超高效液相色谱－串联质谱法测定奶粉中16种苯并咪唑类药物残留量

赵超群，刘 柱，徐潇颖，罗金文

（浙江省食品药品检验研究院，杭州310052）

苯并咪唑是一种含有2个氮原子的苯并杂环化合物，这种特殊的结构使得苯并咪唑类化合物具有良好的生物活性［1］，可用作组胺受体拮抗剂、质子泵抑制剂，还有抗高血压、抗寄生虫的治疗作用［2］。苯并咪唑类化合物在兽医临床上也应用广泛，是许多寄生蠕虫疾病的首选药物，疗效明显［3］。由于一些苯并咪唑类药物及其代谢物在动物和靶动物安全评价试验中表现出致畸和致突变的作用，虽然其在体内很快代谢，但一些代谢物，如亚砜化物、羟化产物等仍具有胚胎毒性，因此许多国家已将苯并咪唑类药物及其代谢物同时作为限用物质进行监控。欧盟规定阿苯达唑、芬苯达唑和奥芬达唑在牛奶中的残留限量分别为100，10，10μg·kg－1；我国农业部公告第235号令规定阿苯达唑、芬苯达唑、奥芬达唑、噻苯咪唑在牛奶中的残留限量均为100μg·kg－1。但目前使用的标准方法及文献报道基本是针对动物源性食品中的苯并咪唑类药物残留的检测［4］，对奶粉中的苯并咪唑类药物残留检测方法报道较少。在质量安全意识淡薄和经济利益的驱使下，对泌乳牛用药不当或不注意停药时间均会造成牛奶中苯并咪唑等兽药的超标残留，摄入人体后，同样会影响人体健康。国内外报道的测定苯并咪唑类药物的方法主要有液相色谱法［5－8］、液相 色谱－质谱联 用法［9－11］、荧光光谱法［12］、免疫测定法［13］和高效毛细管电泳法［14］等，但同时测定奶粉中16种苯并咪唑类药物残留的方法鲜见报道。本工作采用超高效液相色谱－串联质谱法同时测定奶粉中的16种苯并咪唑类药物残留量，可为建立高效灵敏的方法用于日常检测提供依据。

1 试验部分

1．1 仪器与试剂

Waters T－QS型液相色谱－质谱联用色谱仪；Milli－Q型超纯水仪；Waters Oasis MCX固相萃取柱（6cc，500mg）。

单标准储备溶液：0．500g·L－1，分别称取奥芬达唑、芬苯达唑、奥芬达唑砜、阿苯达唑、阿苯达唑－2－氨基砜、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑砜、甲苯咪唑、氨基甲苯咪唑、羟基甲苯咪唑、噻苯咪唑、5－羟基噻苯咪唑、氟苯咪唑、2－氨基氟苯咪唑、噻苯咪唑酯、丙氧苯咪唑各10．0mg，用甲醇溶解，并定容至20mL，于4℃保存。使用时，取各单标准储备溶液适量，混合后用乙腈稀释至所需质量浓度，配制成混合标准储备溶液。

甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯，其他所用试剂均为分析纯；试验用水为超纯水。

1．2 仪器工作条件

1）色谱条件 Waters ACQUITY UPLC BEH色谱柱（2．1mm×50mm，1．7μm）；柱温35℃；流量0．35mL·min－1；进样量2μL；流动相 A 为0．02%（体积分数，下同）甲酸溶液，B为乙腈。梯度洗脱程序：0～6．0min时，B由12%升至55%；6．0～6．1min时，B由55%降至12%，保持2min。

2）质谱条件 电喷雾正离子源（ESI＋），离子源温度500℃；电离电压3．5kV；碰撞气流量800L·h－1；多反应监测（MRM）模式。16种药物的监测离子对及相关参数见表1，其中“＊”表示定量离子。

表1 质谱参数Tab．1 MS parameters

1．3 试验方法

1．3．1 样品提取

称取样品2．000 0g至50mL高速离心管中，加入0．1mol·L－1盐酸溶液8mL溶解，加入乙腈7mL，涡旋混合，超声提取5min，以4 000r·min－1转速离心5min。

1．3．2 净化

MCX固相萃取柱（6cc，500mg）经甲醇5mL活化，0．1mol·L－1盐酸溶液5mL平衡后，将样品上清液全部过柱，控制流量每秒1～2滴，然后依次使用0．1mol·L－1盐酸溶液5mL、甲醇5mL淋洗，氨水－乙腈（1＋9）溶液15mL洗脱。收集全部洗脱液，于38℃旋转蒸发至近干，加入乙腈0．5mL，超声振荡5min，加入0．025mol·L－1乙酸铵溶液1．5mL，漩涡混匀。取上述溶液0．5mL，加入乙腈（2＋8）溶液4．5mL，经0．22μm有机微孔滤膜过滤后转移至进样瓶中，按仪器工作条件进行测定。

2 结果与讨论

2．1 色谱行为

混合标准溶液的总离子流色谱图见图1，16种化合物的提取离子流图见图2。

图1 总离子流色谱图Fig．1 TIC chromatogram

图2 16种化合物的提取离子流图Fig．2 Extraction ion chromatograms of 16compounds

2．2 提取条件的选择

苯并咪唑类药物属于弱碱性化合物，中等极性，易溶于极性有机溶剂，在水中溶解度较小。但奶粉中含有大量蛋白质及脂肪等基质，直接用有机溶剂提取会沉淀蛋白质，影响目标化合物的提取。试验分别考察了0．1mol·L－1盐酸溶液－乙腈提取和乙酸乙酯萃取两种方式对目标物的提取效果。

当溶液呈酸性时，弱碱性的苯并咪唑类药物的溶解度增大。试验中先用0．1mol·L－1盐酸溶液8mL溶解奶粉，再加入乙腈7mL，涡旋混匀，奶粉能在溶液中混合均匀，超声提取离心后即可上固相萃取柱净化。

水溶液的酸度对苯并咪唑类药物的影响较大，当调节水溶液为碱性时，苯并咪唑类药物为分子状态，溶解度减小，更易被有机溶剂萃取。将奶粉先溶于1%（质量分数）氢氧化钾溶液中，加入氯化钠2g，再用乙酸乙酯萃取2次，合并上清液于38℃旋转蒸发至近干，残渣先用乙腈1．5mL超声溶解，再加入0．1mol·L－1盐酸溶液1．5mL，避免乙腈与正己烷液液分配脱脂时产生乳化现象，涡旋混匀，加入正己烷重复洗涤去脂，脱脂后的样品加入0．1mol·L－1盐酸溶液3mL涡旋混匀，上固相萃取柱净化。

结果表明：两种方式的回收率均较高，但基于经济效益及操作便利性的考虑，试验选择0．1mol·L－1盐酸溶液－乙腈提取，具体的提取条件见1．3．1节。

2．3 净化条件的选择

奶粉中的基质较为复杂，包括蛋白质、脂肪、糖类、矿物质和维生素等，提取后需净化才能上机分析，否则会污染离子源。苯并咪唑类药物为弱碱性，试验选择适合于碱性化合物吸附的 Waters Oasis MCX固相萃取柱，对复杂的样品基质净化效果较好。同时需考虑固相萃取柱的饱和载量，试验选用了（6cc，500mg）、（3cc，60mg）等两种大小的固相萃取柱。结果表明：当使用纯对照品上柱分析时，二者保留能力相同。

试验进一步分别考察了4，10，20μg·L－1等3个基质加标提取液上柱分析时两种固相萃取柱保留能力的差别。结果表明：当加标质量浓度为4μg·L－1时，小体积容量柱的保留为大体积容量柱的90%以上；当加标质量浓度为10μg·L－1时，小体积容量柱的保留约为大体积容量柱的50%；当加标质量浓度为20μg·L－1时，小体积容量柱的保留为大体积容量柱的40%以上。说明当使用基质加标提取液上柱分析时，MCX固相萃取柱（3cc，60mg）会产生过载现象。综上所述，试验选择Waters Oasis MCX固相萃取柱（6cc，500mg）为净化柱。

2．4 色谱条件的选择

2．4．1 色谱柱

16种苯并咪唑类药物在C18色谱柱上均有较强的保留，在相同的流动相比例下分别考察了几种C18色谱柱对16种苯并咪唑类药物的分离效果。试验结果表明：Waters ACQUITY UPLC BEH 色谱柱（2．1mm×50mm，1．7μm）的分离效果较好，除噻苯咪唑与阿苯达唑－2－氨基砜、2－氨基氟苯咪唑与阿苯达唑砜、羟基甲苯咪唑与氨基甲苯咪唑不能完全分离，其他各化合物均能很好地分离，且峰形良好，见图1。试验选择 Waters ACQUITY UPLC BEH色谱柱为分析柱。

2．4．2 流动相

试验分别用纯水和0．02%甲酸溶液为水相，对分离效果进行了比较，结果表明：使用0．02%甲酸溶液响应值更高，在ESI＋模式下，水相中加入甲酸有利于提高待测化合物的离子化效率。分别以甲醇、乙腈为有机相，对分离效果进行了比较，结果表明：使用乙腈时，分离效果更好。试验选择以0．02%甲酸溶液为水相，乙腈为有机相进行梯度洗脱，梯度洗脱程序见1．2节。

2．5 质谱条件的选择

质谱中最常用的离子源有大气压力化学电离源（APCI）和电喷雾离子源（ESI）两种，APCI比较适合于中性或极性小的化合物的分析，而ESI则更适合于极性大的酸性或碱性化合物的分析。苯并咪唑类药物属于中等极性的弱碱性化合物，因此试验采用ESI。将混合标准溶液以蠕动泵注射的方式注入质谱，分别在正负离子模式下进行扫描，在正离子模式下均有较好响应的准分子离子峰，并在MRM模式下优化仪器参数，使测定灵敏度更高。优化的质谱条件见1．2节。

苯并咪唑类药物均有苯并咪唑杂环结构，因此在质谱图中容易出现相同的碎片离子［15］，如阿苯达唑砜与羟基甲苯咪唑的相对分子质量相近，在单标准溶液进样，用子离子扫描模式确定监测离子对时，阿苯达唑砜与羟基甲苯咪唑会产生相同的离子对m／z 298／159，298／266。为了使这两种化合物分离，在保证灵敏度的条件下尽可能选择各自特有的特征离子对，试验选择阿苯达唑砜的监测离子对为m／z298．17／224．00，298．17／190．80，羟基甲苯咪唑监 测 离 子 对 为 m／z 298．00／265．90，298．00／107．20。优化的质谱参数见表1。

2．6 工作曲线和检出限

称取空白样品2．000g置于50mL离心管中，分别加入混合标准储备液适量，按照试验方法进行前处理，作为检出限及测定下限的基质工作溶液。当进样量为2μL时，根据3倍和10倍信噪比，分别确定检出限（3S／N）以及测定下限（10S／N），结果见表2。对于前处理复杂的样品，当定量分析单个或少量几个待测组分时，可采用同位素稀释内标法，但当分析种类较多的化合物组分时，需要多个内标，增加了方法的复杂性和成本。试验中基质较单一，采用基质加标外标法定量，以测定下限为最低质量分数，20倍测定下限为最高质量分数，作系列质量分数基质加标工作曲线溶液，以峰面积对质量分数进行线性回归，结果见表2。

表2 线性参数、检出限和测定下限Tab．2 Linearity parameters，detection limits and lower limits of determination

2．7 精密度和回收试验

分别在低（2倍测定下限）、中（4倍测定下限）、高（20倍测定下限）等3个浓度水平下对空白样品进行加标回收试验，每个浓度水平平行测定6次，其加标回收率和测定值的相对标准偏差（RSD）见表3。

表3（续）

由表3可知：RSD（n＝6）均小于9．0%，表明方法具有较好的重复性。

2．8 样品分析

将10批奶粉样品，按照试验方法进行测定，通过比较样品与对照品图谱的保留时间以及监测离子通道的丰度比，测定样品中苯并咪唑类药物的含量。结果表明：16种苯并咪唑类药物在10批样品中均未检出。

本工作采用超高效液相色谱－串联质谱法测定奶粉中苯并咪唑类药物残留量。方法操作简单、专属性强、灵敏度高、准确性好，可满足奶粉中的苯并咪唑类药物残留量的测定要求。

［1］ 张晓峰，许志忠，王延伟，等．具生物活性的苯并咪唑类衍生物研究进展［J］．广东化工，2014，41（19）：265－266．

［2］ 孟江平，耿蓉霞，周成合，等．苯并咪唑类药物研究进展［J］．中国新药杂志，2009，18（16）：1505－1514．

［3］ 高学军，李庆章．苯并咪唑氨基甲酸酯类抗蠕虫药物作用机理研究进展［J］．东北农业大学学报，2004，35（4）：492－495．

［4］ 陈飞，万宇平，冯静，等．动物组织中苯并咪唑类药物多残留ELISA方法的建立［J］．中国酿造，2013，32（8）：144－147．

［5］ 林海丹，林峰，张美金，等．高效液相色谱法同时测定动物组织中16种苯并咪唑类药物残留［J］．食品科学，2011，32（2）：231－236．

［6］ SU S C，CHANG C L，CHANG P C，et al．Simultaneous determination of albendazole，thiabendazole，mebendazole and their metabolites in livestock by high performance liquid chromatography［J］．Journal of Food and Drug Analysis，2003，11（4）：307－319．

［7］ DUSI G，GAMBA V，FAGGIONATO E．Rapid de－termination of the antiparasitic drugs flubendazole and febantel in feeds by HPLC with ultraviolet detection［J］．Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2005，38（2）：375－379．

［8］ GUZMAN－VAZQUEZ A de PRADA，MENA M L，REVIEJO A J，et al．Voltammetric behavior and determination by flow injection with amperometric detection of benzimidazoles［J］．Analytical Letters，2004，37（1）：65－79．

［9］ 汤娟，吴斌，景苏，等．高效液相色谱－串联质谱测定奶粉中3种苯并咪唑类药物残留［J］．质谱学报，2012，33（1）：13－17．

［10］ 刘琪，朱馨乐，孙雷，等．高效液相色谱－串联质谱法检测猪肝中苯并咪唑类药物及其代谢物的残留量［J］．中国兽药杂志，2010，44（2）：1－6．

［11］ 郭强，常孝勇．动物组织中苯并咪唑类药物检测的LC－MS／MS法研究［J］．河南农业科学，2012，41（2）：152－156．

［12］ ARENAS R V，RAHMAN H，JOHNSON N A．Determination of thiabendazole residues in white and sweet potatoes by liquid chromatography with fluorescence detection［J］．J AOAC Int，1995，78（6）：1455－1458．

［13］ BRANDON D L，HOLLAND K P，DREAS J S，et al．Rapid screening for benzimidazole residues in bovine liver［J］．J Agric Food Chem，1998，46（9）：3653－3656．

［14］ SHEN J Z，TONG J，JIANG H Y，et al．Simultaneous determination of five benzimidazoles in feeds using high－performance capillary electrophoresis［J］．J AOAC Int，2009，92（4）：1009－1015．

［15］ 刘洪斌，于洪侠，刘佳佳，等．高效液相色谱－串联质谱法检测牛奶中多种苯并咪唑兽药残留［J］．分析试验室，2011，30（3）：13－17．