DNA－Fe配合物生物聚合离子膜修饰玻碳电极的制备及其用作过氧化氢电化学传感器的研究

南明君，顾婷婷，周 洋，贾楠楠，王 旭

（辽宁科技大学 化学工程学院，鞍山114051）

生物聚合离子膜（BPICM）是聚合离子膜的一种，是由带相反电荷的生物聚合离子材料通过静电作用而形成。BPICM不仅具备聚合离子膜的制作简单、稳定性强、选择性高和渗透性强等特点，还具有良好的生物相容性。BPICM已被用于催化反应膜和生物大分子识别膜等生物感应界面的构筑［1－6］。由于DNA具有特异的分子识别能力以及一定的导电性，且DNA分子是带负电荷的聚合阴离子，可以与带正电荷的天然聚合阳离子材料形成DNA BPICM，本课题组已经成功地将DNA BPICM应用于电化学生物传感器分子识别界面的构筑［5－6］。由于DNA BPICM本身不具备电化学活性，利用一些电化学电子媒介体分子（铁氰化钾、亚甲基蓝等）及具有催化活性的过渡金属离子（Cu2＋、Ni2＋等）与DNA的特异性结合作用，可以将这些分子固定在BPICM表面，从而实现DNA BPICM作为电化学活性和催化活性界面的构筑［1－2，4］。

人体内许多生化反应产物含有过氧化氢，当过氧化氢含量过多时可以加速细胞老化，DNA损伤，诱发基因突变。同时，测定过氧化氢也是测定其他产生过氧化氢中间产物的基础。目前过氧化氢主要的测定方法包括高效液相色谱法、荧光光度法和电化学法等。电化学法由于具有灵敏度高、响应快速、成本较低的特点，广泛应用在过氧化氢的检测中［7－19］。近些年，各种纳米材料修饰电极，如碳纳米管、石墨烯、纳米金属及其氧化物等［7－14］被用于过氧化氢的高敏感度检测，但纳米材料的增加对人体以及环境又带来一定的危害［7－11］。

本工作利用DNA与天然聚合阳离子－壳聚糖形成DNA－CTS BPICM，通过形成DNA－金属离子配合物将铁离子固定在玻碳电极表面，形成DNAFe／CTS BPICM修饰电极，研究了该修饰电极的电活性和催化活性。在此基础上，发展了一种基于生物材料的过氧化氢电化学传感器。

1 试验部分

1．1 仪器与试剂

CHI 832型电化学分析仪；三电极系统：玻碳圆盘电极（GCE，直径3mm）为工作电极，银／氯化银（饱和氯化钾）电极为参比电极，铂丝电极（直径1mm）为辅助电极；ΣIGMA／HD型扫描电子显微镜（SEM）。

鲑鱼精DNA溶液：1．00g·L－1。

三氯化铁溶液：3．00mmol·L－1。

壳聚糖（CTS）溶液：0．50g·L－1。

磷酸缓冲溶液（PBS）：0．1mol·L－1磷酸氢二钾溶液与磷酸二氢钾溶液配制pH 7．0的磷酸缓冲溶液。

试剂均为分析纯，试验用水为二次去离子水。

1．2 修饰电极的制备

玻碳电极分别用纳米研磨垫以及加研磨粉的研磨垫抛光3min，成镜面，在水中超声除去电极表面的杂质，再用水冲洗后置于室温干燥。将1．00g·L－1DNA溶液与1．00mmol·L－1三氯化铁溶液振荡混合后，得DNA－Fe（Ⅲ）配合物（DNA－Fe）。移取DNA－Fe 20μL滴涂于经抛光的GCE表面，然后滴加0．50g·L－1CTS溶液10μL，罩在1L烧杯下，于室温（约20℃）下干燥22h，用水冲去表面吸附的杂质，在4℃保存，制得 DNA－Fe／CTS修饰电极。空白对比的DNA／CTS修饰电极以相同方法制备。

1．3 电化学检测

以各修饰电极为工作电极、银／氯化银为参比电极及铂电极为辅助电极。置于pH 7．0的PBS 10mL中，在试验前通入氮气30min，进行循环伏安法（CV）和安培－时间曲线法（i－t）检测。

1．4 扫描电子显微镜表征

DNA－Fe／CTS BPICM 制备过程同电极制备。扫描电子显微镜（SEM）分析之前，在电极表面镀一层10nm的铂金。用同样的方法制备表征DNA／CTS BPICM。

2 结果与讨论

2．1 DNA－Fe／CTS BPICM 的扫描电子显微镜表征

DNA／CTS BPICM 和 DNA－Fe／CTS BPICM的SEM图片见图1。

图1 DNA／CTS BPICM 与DNA－Fe／CTS BPICM 的SEM 图片Fig．1 SEM images of DNA／CTS BPICM and DNA－Fe／CTS BPICM

由图1可知：DNA／CTS BPICM显示较为光滑的表面，固定了DNA－Fe（Ⅲ）配合物之后显示为较粗糙的颗粒状表面。

2．2 DNA－Fe／CTS BPICM 修饰电极的电化学表征

裸 电 极 上 FeCl3、DNA－Fe／GCE、DNA－Fe／CTS／GCE的循环伏安图见图2。

图2 Fe／GCE、DNA－Fe／GCE和DNA－Fe／CTS／GCE的循环伏安图Fig．2 CV－grams of Fe／GCE，DNA－Fe／GCE and DNA－Fe／CTS／GCE

结果表明：在－0．4～0．5V内，裸电极上三氯化铁的CV扫描曲线出现了一对氧化还原峰（势电位为－0．03V），由文献［20］可知此氧化还原峰来自于Fe3＋／Fe2＋电对；当与DNA共存时，此氧化还原峰发生负移（势电位为－0．064V），峰电流增大，根据文献［21］提出的，势电位发生负移，表明Fe3＋与DNA形成DNA－Fe配合物；DNA－Fe／CTS／GCE循环伏安曲线出现了一对明显的氧化还原峰（图2、图3），氧化还原峰电位分别为Epa＝－0．036V，Epc＝－0．095V，势电位为－0．065 5V。

在相同条件下，裸GCE和DNA／CTS／GCE都没有明显的氧化还原峰，说明DNA和CTS都没有明显的电化学活性，此氧化还原峰来源于DNA－Fe配合物在电极表面的氧化还原反应，表明DNA－Fe配合物被成功地固定在电极表面，见图3。

对DNA－Fe／CTS修饰电极连续扫描50圈，试验结果表明：其氧化还原峰电流变化不明显，表现了较好的稳定性。ΔEp＝│Epa－Epc│＝0．059V，与文献［22］所给59mV相符，表明该反应为单电子转移，｜Ipa／Ipc｜≈1说明为准可逆电对。

试验也考察了扫描速率为5～500mV·s－1时对电极的氧化还原峰的影响，见图4。

图3 GCE、DNA／CTS／GCE和DNA－Fe／CTS／GCE的循环伏安图Fig．3 CV－grams of GCE，DNA／CTS／GCE and DNA－Fe／CTS／GCE

图4 DNA－Fe／CTS／GCE在不同扫描速率下的循环伏安图Fig．4 CV－grams of DNA－Fe／CTS／GCE with different scanning rates

由图4可知：在所用的扫描速率范围内，峰电位与扫描速率无关，峰电流随着扫描速率的增大而增大，且峰电流与扫描速率的一次方成正比，表明该电极表面电化学反应受电子转移控制［23］，根据Laviron方程［24］，计算得到的 DNA－Fe配合物在电极表面的电子转移速率为18．10s－1，大于同样条件下Fe3＋在溶液中的电子转移速率（11．79s－1），表明DNA－Fe在电极表面保持较好的电化学活性。

DNA－Fe／CTS／GCE在不同酸度下的循环伏安图见图5。

由图5可知：在pH 6．0～8．0时，DNA－Fe的氧化还原电位随着溶液pH的增加向负向移动，表明DNA－Fe与电极表面发生的电子转移反应有质子参与；势电位与pH呈线性关系，斜率为－73．9mV。与理论值－59mV（等电子等质子）相当［24］，为单质子参与反应。

2．3 DNA－Fe／CTS BPICM 修饰电极对过氧化氢的响应

图5 DNA－Fe／CTS／GCE在不同酸度下的循环伏安图Fig．5 CV－grams of DNA－Fe／CTS／GCE at different acidities

图6 修饰电极对过氧化氢响应的循环伏安图Fig．6 CV－grams showing respense to H2O2 at the modified electrode

图6为DNA－Fe／CTS修饰电极对不同浓度过氧化氢的电化学响应的循环伏安图。当溶液中加入过氧化氢后，DNA－Fe／CTS修饰电极的还原峰电流随着过氧化氢浓度的升高而增大，同时氧化峰电流随着过氧化氢浓度的升高而减少。这是由于过氧化氢的加入使得Fe2＋原本在电极表面完成的氧化反应转移至溶液中，与过氧化氢反应，表明DNA－Fe配合物对过氧化氢具有催化活性。电极表面以及溶液中的电化学反应如下：

在此基础上，利用安培－时间曲线法考察了修饰电极的还原峰电流增量（ΔI）随过氧化氢浓度变化的响应，见图7。结果表明：在－0．20V的工作电位下，随着溶液中过氧化氢浓度的增加，DNA－Fe／CTS电极响应电流逐渐增大，电极到达稳态电流的响应时间约为6s。相比之下，裸电极对过氧化氢电流较不明显。表明修饰电极的电化学响应主要来自于 DNA－Fe／CTS BPICM。

图7 修饰电极对过氧化氢响应安培－时间曲线Fig．7 ΔI－t curve showing response to H2O2at the modified electrode

试验考察了工作电位对过氧化氢响应的影响，结果表明：电位在－0．10～－0．35V之间，随着电位的升高，响应电流逐渐增大；电位在－0．20～－0．25V时，响应电流逐渐稳定。由于在高电位下干扰物质会产生干扰电流，试验选定工作电位为－0．20V。

2．4 DNA－Fe／CTS BPICM 修饰电极的抗干扰性能

用DNA－Fe／CTS BPICM修饰电极对可能干扰物进行了检测。结果表明：当葡萄糖和尿酸以高于10倍过氧化氢浓度存在时，两者都没有产生明显的电流响应，再添加过氧化氢后对电流响应仍没有影响，说明电极对葡萄糖和尿酸具有较好的抗干扰能力。

2．5 标准曲线和检出限

试验考察了DNA－Fe／CTS BPICM 修饰电极对过氧化氢响应的电流随其浓度的变化情况。结果表明：过氧化氢的浓度在0．01～2．0mmol·L－1范围内，DNA－Fe／CTS BPICM 修饰电极对过氧化氢响应的电流与过氧化氢浓度呈线性关系，线性回归方程为y＝53．42x＋6．985，相关系数为0．991 2。检出限（3S／N）为3μmol·L－1，灵敏度为53．417nA／（mmol·L－1）。

2．6 稳定性和重现性试验

DNA－Fe／CTS BPICM 修饰电极的稳定性以及重现性考查结果表明，5个电极5次试验测定的标准偏差为5．6%，具有较好的重现性。电极在4℃下保存，经过30d后其响应电流比第一次检测降低了12．5%。

2．7 过氧化氢传感器的检测性能对比

表1中对比了一些纳米材料修饰电极对过氧化氢的检测性能，本试验结果的线性范围、检出限与大多数无酶纳米材料添加型的修饰电极相当，但工作电位较低，因此可避免高电位下电活性物质的干扰。

表1 过氧化氢传感器的检测性能对比Tab．1 Comparison of detection performance of H2O2sensors

本工作利用生物聚合离子膜固定DNA－Fe配合物，构筑基于DNA－Fe／CTS BPICM 修饰电极，利用扫描电子显微镜、循环伏安法、安培－时间曲线法对聚合离子膜进行表征。结果表明：DNA－Fe／CTS BPICM修饰电极具有良好的电化学性能，对过氧化氢具有很好的催化活性，可以用作以过氧化氢为中间产物的生化代谢反应物检测，且具有良好的稳定性、重现性、生物相容性，有潜在的应用价值。

［1］ GU T，HASEBE Y．Novel amperometric assay for drug－DNA interaction based on an inhibitory effect on an electrocatalytic activity of DNA－Cu（Ⅱ）complex［J］．Biosensors and Bioelectronics，2012，33（1）：222－227．

［2］ GU T，HASEBE Y．DNA－Cu（Ⅱ）poly（amine）complex membrane as novel catalytic layer for highly sensitive amperometric determination of hydrogen peroxide［J］．Biosensors and Bioelectronics，2006，21（11）：2121－2128．

［3］ GU T，HASEBE Y．Peroxidase and methylene blueincorporated double stranded DNA－polyamine complex membrane for electrochemical sensing of hydrogen peroxide［J］．Analytica Chimica Acta，2004，525（2）：191－198．

［4］ GU T，LIU Y，ZHANG J，et al．Amperometric hydrogen peroxide biosensor based on immobilization of DNA－Cu（Ⅱ）in DNA／chitosan polyion complex membrane［J］．Journal of Environmental Sciences，2009，21（1）：56－59．

［5］ GU T，ZHANG Y，DENG F，et al．Direct electrochemistry of glucose oxidase and biosensing for glucose based on DNA／chitosan film［J］．Journal of Environmental Sciences，2011，23（s）：s66－s69．

［6］ 顾婷婷，夏洪齐．基于DNA－甲苯胺蓝生物聚合离子膜的多环有机物电化学传感器的研究［J］．理化检验－化学分册，2014，50（9）：1070－1075．

［7］ NIA P M，LORESTANI F，MENG W P，et al．A novel non－enzymatic H2O2sensor based on polypyrrole nanofibers－silver nanoparticles decorated reduced graphene oxide nano composites［J］．Applied Surface Science，2015，332：648－656．

［8］ YANG L Z，XU C L，YE W C，et al．An electrochemical sensor for H2O2based on a new Co－metal－organic framework modified electrode［J］．Sensors and Actuators B：Chemical，2015，215（4）：489－496．

［9］ KHAN S B，RAHMAN M M，ASIRI A M，et al．Fabrication of non－enzymatic sensor using Co doped ZnO nanoparticles as a marker of H2O2［J］．Physica E：Low－dimensional Systems and Nanostructures，2014，62：21－27．

［10］ SAHIN O G．Microwave－assisted synthesis of PtAu＠C based bimetallic nanocatalysts for non－enzymatic H2O2sensor［J］．Electrochimica Acta，2015，180：873－878．

［11］ ZHANG J X，TU L P，ZHAO S，et al．Fluorescent gold nanoclusters based photo－electrochemical sensors for detection of H2O2and glucose［J］．Biosensors and Bioelectronics，2015，67：296－302．

［12］ 许艳霞，倪小英，邓志坚，等．基于血红蛋白在纳米银溶胶修饰玻碳电极上电化学反应的过氧化氢传感器［J］．理化检验－化学分册，2016，52（5）：518－523．

［13］ YU C M，WANG L，LI W B，et al．Detection of cellular H2O2in living cells based on horseradish peroxidase at the interface of Au nanoparticles decorated graphene oxide［J］．Sensors and Actuators B：Chemical，2015，211：17－24．

［14］ ZHOU K F，ZHU Y H，YANG X L，et al．A novel hydrogen peroxide biosensor based on Au－graphene－HRP－chitosan biocomposites［J］．Electrochimica Acta，2010，55（9）：3055－3060．

［15］ 汪涛，王朝霞，王学亮，等．基于血红蛋白／金纳米粒子／聚二烯丙基二甲基氯化铵－多壁碳纳米管生物传感器测定过氧化氢［J］．理化检验－化学分册，2013，49（5）：577－579．

［16］ 倪鹏，江涛，施锦辉，等．石墨烯／酶纳米复合多层膜修饰电极测定食品中的过氧化氢含量［J］．理化检验－化学分册，2016，52（6）：648－651．

［17］ VILIAN A T E，CHEN S M，LOU B S．A simple strategy for the immobilization of catalase on multiwalled carbon nanotube／poly（L－lysine）biocomposite for the detection of H2O2and iodate［J］．Biosensors and Bioelectronics，2014，61：639－647．

［18］ NALINI S，NANDINI S，SHANMUGAM S，et al．Amperometric hydrogen peroxide and cholesterol biosensors designed by using hierarchical curtailed silver flowers functionalized graphene and enzymes deposits［J］．Journal of Solid State Electrochemistry，2014，18（3）：685－701．

［19］ MERCEDES A，PIETRO V，CARME R．The reaction mechanisms of heme catalases：An atomistic view by ab initio molecular dynamics［J］．Archives of Biochemistry and Biophysics，2012，525（2）：121－130．

［20］ 崔焱，华一新，李艳，等．Fe（Ⅲ）／Fe（Ⅱ）在［Bmim］BF4－FeCl3－H2O体系中的电化学行为［J］．有色金属（冶炼部分），2009（3）：2－6．

［21］ CARTER M T，BARD A J．Voltammetric studies of the interaction of tris（1，10－phenanthroline）cobalt（Ⅲ）with DNA［J］．Journal of the American Chemical Society，2002，109（24）：7528－7530．

［22］ 约瑟夫·王．分析电化学［M］．3版．朱永春，张玲，译．北京：化学工业出版社，2009：28－31．

［23］ LIANG R P，CHEN Y X，QIU J D．A sensitive amperometric immunosensor for hepatitis B surface antigen based on biocompatible redox－active chitosantoluidine blue／gold nanoparticles composite film［J］．Analytical Methods，2011，3（6）：1338－1343．

［24］ LAVIRON E．General expression of the linear potential sweep voltammogram in the case of diffusionless electrochemical systems［J］．Journal of Electroanalytical Chemistry and Interfacial Electrochemistry，1979，101（1）：19－28．

［25］ LIU S，TIAN J Q，WANG L，et al．A method for the production of reduced graphene oxide using benzylamine as a reducing and stabilizing agent and its subsequent decoration with Ag nanoparticles for enzymeless hydrogen peroxide detection［J］．Carbon，2011，49（10）：3158－3164．

［26］ ZHONG L J，GAN S Y，FU X G，et al．Electrochemically controlled growth of silver nanocrystals on graphene thin film and applications for efficient nonenzymatic H2O2biosensor［J］．Electrochimica Acta，2013，89：222－228．

［27］ PETR J，VERONIKA U，ZDENKA M，et al．Novel Fe＠Fe－O＠Ag nanocomposite for efficient non－enzymatic sensing of hydrogen peroxide［J］．Electrochimica Acta，2015，153：62－67．