天然寄主替代茶叶增殖EgNPV的方法

谭荣荣，毛迎新，黄丹娟，王友平

(湖北省农业科学院 a果树茶叶研究所 湖北省农业科技创新中心果茶分中心，b植保土肥研究所，湖北 武汉 430064)

灰茶尺蠖(EctropisgrisescensWarren)属鳞翅目尺蛾科害虫，中国各茶区均有发生，尤以鄂、湘、皖等地及江浙一带最为严重。以幼虫食叶为害，严重发生时，茶树叶片及嫩芽被啃食殆尽，状如火烧，严重影响茶叶产量，且易导致茶树早衰、耐寒力差[1]。灰茶尺蠖在鄂东、鄂南等局部地区频繁暴发成灾，年发生5～6代，除第1代发生整齐外，其余各世代重叠，防治难度较大。灰茶尺蠖核型多角体病毒EctropiegrisescensNucleopolyhedrovirus (EgNPV)是灰茶尺蠖重要的病原微生物，对灰茶尺蠖幼虫具有较强的侵染力和毒力，对灰茶尺蠖田间种群具有良好的控制作用，对人、畜及天敌昆虫安全[2-3]，尤其可通过水平扩散和垂直传播途径形成病毒流行链，实现对靶标害虫持续控制[4]。灰茶尺蠖核型多角体病毒专择性极强，只能在寄主活体内或细胞中增殖，生产条件要求相对严格，因此能否解决病毒生产问题成为该病毒在生产实际中能否发挥作用的关键。目前，生产灰茶尺蠖病毒主要采用室内宿主活体增殖的方式，即通过接毒感染宿主幼虫生产病毒。但由于使用传统方法，即用茶树新梢养虫生产病毒效率低、成本高，不适宜作为饲料大规模养虫增殖病毒。为此，本研究从筛选新的天然替代饲料入手，以期有效解决灰茶尺蠖病毒大量扩繁的难题。

1 材料与方法

1.1 材料

灰茶尺蠖蛹采自湖北省农业科学院果树茶叶研究所试验基地，天然替代饲料由湖北省农业科学院果树茶叶研究所提供。该天然替代饲料接骨草(Sambucuschinensis)为多年生草本植物，喜温湿气候，分布广泛，在我国浙江、安徽、江西、湖南、湖北、福建、广东、广西、四川等省区野生或栽培，其人工栽培可种子繁殖或分株繁殖。

1.2 灰茶尺蠖饲养方法

将健康灰茶尺蠖蛹置于消毒后的养虫容器内，室温下待虫蛹羽化后，在养虫容器内放入10%蔗糖溶液供成虫补充营养，并以高密纱布覆盖养虫容器，供交配后雌虫在其表面产卵。始见初孵幼虫后，开始用细口瓶水培接骨草或茶枝，置于养虫容器周围，供孵出的幼虫取食。每个容器承装4瓶接骨草或茶枝，饲养龄期一致的幼虫300～500头，养虫容器覆盖双层高密纱布，防止幼虫逃逸。在整个幼虫饲养过程中，根据饲料新鲜程度和被取食程度，更换和添加饲料，饲养直至幼虫化蛹。

1.3 天然替代饲料增殖病毒方法

待灰茶尺蠖成虫产卵幼虫孵化后，先用替代原料喂养灰茶尺蠖幼虫，当灰茶尺蠖幼虫长至3龄，开始接种病毒(接毒浓度为5×106PIB·mL-1)。接种病毒5 d后开始逐日收集染毒死虫。收集的虫尸加50%甘油，置-20 ℃下保存备用。

1.4 灰茶尺蠖核型多角体病毒提纯

将感染病毒死亡的灰茶尺蠖虫尸加PBS缓冲液充分研磨后，4层纱布过滤，将滤液置于4 ℃条件下离心，500 r·min-1离心5 min弃沉淀，上清液再用3 500 r·min-1离心30 min，然后用适量缓冲液重新悬浮沉淀，3 500 r·min-1离心30 min。差速离心反复进行多次，直至多角体悬液呈乳白色状。病毒用血球计数板计数后，使用等体积PBS缓冲液稀释，于4 ℃冰箱保存待用。

2 结果与分析

2.1 不同饲料饲养对灰茶尺蠖生长的影响

采用接骨草饲养灰茶尺蠖一个世代，以茶叶喂养为对照。表1表明，以接骨草饲养的灰茶尺蠖幼虫发育历期14.5 d，较对照延长1～2 d，幼虫存活率85.7%，蛹重89.78 mg，蛹发育历期8.25 d，羽化率84.3%，每雌平均产卵量138.6粒，卵孵化率86.4%，其各项指标与对照无显著差异。通过试验观察还发现，水培接骨草存放时间较久，出现萎蔫一般在5 d以上，饲养方便。同时获取接骨草枝条比茶枝省力，节省人工。且接骨草种植比较方便，成本更低。

表1 接骨草与茶叶饲养灰茶尺蠖的发育指标对比

2.2 接骨草饲养灰茶尺蠖的接毒时期和死亡率

将接骨草养虫增殖的病毒提纯，分别稀释成2.5×106、5.0×106、7.5×106、1.0×107PIB·mL-14个浓度，分别接种1、2、3、4、5龄幼虫，饲养至幼虫化蛹，计算不同浓度病毒感染不同龄期幼虫的死亡率。

表2表明，灰茶尺蠖幼虫3龄前对病毒相对敏感，4～5龄敏感性降低。就感病死虫龄期而言，1龄接毒，3龄前死亡虫数占死亡总数的80%以上；2龄接毒，4龄前死亡虫数占死亡总数的40%；3龄接毒，末龄幼虫染毒死亡数占死亡总数的85%以上。从幼虫发病率、收获病毒量综合考虑，应用接骨草饲养灰茶尺蠖增殖病毒的适宜时期和浓度为3龄幼虫5.0×106PIB·mL-1。

表2 灰茶尺蠖病毒感染不同龄期幼虫的试验结果

注：对照死亡率3.1%。

2.3 接骨草饲养不同世代灰茶尺蠖幼虫增殖病毒效果

在室内自然条件下，以浓度为5.0×106PIB·mL-1病毒液接毒感染各世代灰茶尺蠖3龄幼虫，接毒5 d后逐日收集死虫，记载感病死亡虫数，至幼虫化蛹，计算各代幼虫的感病死亡率，并将各代增殖的病毒虫尸分别称重后进行比较，结果表明，在灰茶尺蠖不同世代都可以进行病毒增殖，其中以第1、2、3和6代为宜(表3)。

表3 不同世代灰茶尺蠖增殖病毒效果比较

2.4 接骨草与茶叶增殖灰茶尺蠖核型多角体病毒效率比较

在灰茶尺蠖第1～5代发生期，以接骨草饲养灰茶尺蠖幼虫增殖病毒，茶叶喂养为对照，各代均饲养至幼虫化蛹，将2种饲料养虫生产的灰茶尺蠖病毒虫尸分别称重，折算成每头虫尸重后，进行比较。表4表明，接骨草养病虫尸重略高于茶叶所养病虫尸重，按照感病宿主虫尸生物量与病毒产量正相关原则，接骨草养虫产毒量高于茶叶养虫的产毒量。

2.5 接骨草与茶叶增殖灰茶尺蠖核型多角体病毒毒力比较

表4 接骨草与茶叶饲养灰茶尺蠖增殖其核型多角体病毒的效率比较

提纯接骨草、茶叶养虫增殖的典型病毒，分别稀释成1×105、5×105、1×106、5×106PIB·mL-14个浓度，室内接毒感染灰茶尺蠖3龄幼虫，接毒5 d后逐日收集感病虫尸，饲养直至幼虫化蛹，记载感病死亡虫数，计算感病死亡率和校正死亡率，并求算毒力回归方程及LC50。表5表明，接骨草养虫增殖的病毒毒力略高于茶叶养虫增殖的病毒。

表5 接骨草与茶叶饲养灰茶尺蠖增殖其核型多角体病毒的毒力比较

注：对照死亡率为3.6%。毒力回归方程接骨草为y=-4.152 3+1.53x，LC50=5.25×105PIB·mL-1；茶叶为y=-0.765 82+1.016 75x，LC50=5.98×105PIB·mL-1。

3 小结与讨论

通常野外接毒和室内接毒都可以实现病毒的增殖，但前者更易受到环境因素制约，如温度、湿度、光照、雨水、肉食性昆虫等，都会对病毒的产量造成影响，甚至导致病毒杀虫活性降低[5-6]；相比之下，室内接毒方式可控性强，病毒生产量稳定，是当前昆虫病毒活体增殖的最主要途径。目前，我国在灰茶尺蠖饲养方面的研究较少，而在其近似种茶尺蠖饲养研究方面已初见成效，可用于灰茶尺蠖室内饲养参考。2007年，陈建明等[7]公开了“一种茶尺蠖的人工饲料，其制备及茶尺蠖的饲养方法”；2005年，张永安等[8]公开了“一种茶尺蠖人工饲养和传代方法”。这2种方法均明确提出茶尺蠖人工饲料配方及应用该饲料全年、继代饲养方法，但文中并未涉及人工饲料养虫产毒效率及病毒毒力等关键技术指标。刘琴等[9]采用人工饲料饲养茶尺蠖发现，幼虫历期和世代历期分别为20和39.62 d，较茶树嫩梢饲养历期分别增加1.44和2.41 d。1992年叶恭银等[10]研究发现，以菊花叶片为饲料，茶尺蠖幼虫取食量、蛹期、蛹重、产卵量、种群特征参数与以茶树叶片为饲料的相比无显著性差异，仅幼虫历期延长1～2 d，以其饲养茶尺蠖增殖病毒量也未受显著影响，但文中未对2种饲料增殖病毒的毒力进行比较，且菊花需要盆栽，操作麻烦，推广应用上较为困难。

本研究使用的接骨草[11]具有2个优点。1)适用性强。接骨草为灰茶尺蠖野生寄主植物，幼虫喜食，生长发育正常。在武汉地区，以接骨草为饲料饲养灰茶尺蠖(第4代)，幼虫发育历期14.5 d，存活率85.7%，蛹历期8.25 d，羽化率84.3%，每雌平均产卵量138.6粒，其各项生物学特征参数与茶叶饲养的参数值无显著性差异；其次接骨草来源广泛，通常在茶园附近、林间、沟边生长，容易获得，成本低廉。2)生产病毒效率高。应用接骨草饲养灰茶尺蠖增殖其核型多角体病毒，使得85%以上幼虫至末龄幼虫期染毒死亡，降低幼虫提早死亡或化蛹的比例。按照感病宿主虫尸生物量与病毒产量正相关原则，以接骨草为饲料增殖病毒量(平均每头重量0.050 7 g)高于茶叶养虫的产毒量(平均每头重量0.049 0 g)。由此看来，采用接骨草饲养灰茶尺蠖能够克服传统饲料无法全年、继代饲养的难题。应用接骨草增殖灰茶尺蠖核型多角体病毒，提高了病毒生产效率和毒力，降低了生产成本，有效解决了病毒大量扩繁的难题，且操作简单，容易被茶农接受，推广应用前景广阔。

[1] 殷坤山，陈华才.喷施茶尺蠖病毒杀虫剂对茶叶品质的影响[J].中国茶叶，2002，24(4)：5.

[2] 谭荣荣，毛迎新，龚自明.地高辛标记DNA探针对茶园NPV的检测[J].湖北农业科学，2013，52(23)：5894-5897.

[3] 叶恭银，朱俊庆，胡萃.茶尺蠖核型多角体病毒对宿主幼虫食物摄取与利用的影响[J].浙江农业大学学报，1995，21(1)：77-80.

[4] 曲良建，张永安，王玉珠，等.PCR法证实棉铃虫核型多角体病毒对棉铃虫经卵和蛹的垂直传播[J].中国生物防治，2005，21(1)：45-48.

[5] 孙修炼，胡志红，彭辉银. 杆状病毒生态学研究进展[J]. Virologica Sinica，2006(2)：200-206.

[6] FUXA J R. Ecology of insect nucleopolyhedroviruses[J]. Agriculture Ecosystems & Environment, 2004，103(1)：27-43.

[7] 陈建明，俞晓平，李骁俊，等.一种茶尺蠖的人工饲料，其制备及茶尺蠖的饲养方法：200710068384.0[P].

[8] 张永安，徐保泯，王玉珠，等.茶尺蠖的人工饲养和传代方法及其幼虫人工饲料：200510116783.0[P].

[9] 刘琴，徐健，李传明，等. 人工饲料条件下茶尺蠖的饲养与繁殖[J]. 茶叶科学，2015，35(4)：323-328.

[10] 叶恭银，胡萃，朱俊庆.菊花叶片作为茶尺蠖饲料并用于其核型多角体病毒增殖的研究[J].华东昆虫学报，1992(2)：27-33.

[11] 王文静，王军，饶高雄.接骨草的两种提取物对小鼠的抗炎镇痛作用[J]. 华西药学杂志，2011，26(3)：247-249.