茶园杂草小飞蓬挥发物对茶小绿叶蝉行为的反应

张 辉，李慧玲，张应根，李良德，王定锋，王庆森，曾明森，吴光远

(福建省农业科学院茶叶研究所，福建 福安 355015)

小飞蓬Conyzacanadensis(L.) Cronq.别名小蓬草、加拿大蓬、小白草，隶属菊科植物，为越年生或一年生草本植物，是福建[1]、贵州[2]、江苏[3]、湖南[4]等主要茶区茶园的具有优势种群的草，是茶园生态系统的组分之一，人们称之为茶园杂草。因为人们认为小飞蓬在茶园生态环境中与茶树生长争夺水肥和光照，与茶树不利。在相同的茶园生态系统中，茶小绿叶蝉被认为是目前危害茶树最严重的昆虫，危害隐蔽，发生世代多，繁殖快，世代重叠严重，防治难度大，以成若虫刺吸茶树嫩芽叶，导致芽叶萎缩，叶脉变红，叶尖、叶缘红褐焦枯，芽梢生长停滞，严重影响茶叶产量和品质[5]。茶小绿叶蝉是杂食性害虫，本寄生于杂草和小灌木，因为20世纪50～60年代垦荒种茶，这种害虫才从杂草和小灌木转移到茶树上并成为优势种。除了茶树之外，它还有其他的嗜好寄主[6]。除草剂的使用使现代茶园生态系统比较单一，植物种物种群结构比较单一仅存茶树。在茶树与杂草、小灌木和乔木混生的50年代茶园，叶蝉是不需要防治的，说明杂草可影响叶蝉生存行为。茶园周围的木本杂草迷迭香Rosmarinusofficinalis具有引诱茶小绿叶蝉的功能[7]，茶小绿叶蝉忌避入侵草本植物胜红蓟AgeratumconyzoidesL.精油[8]，而作为茶园的具有优势种群的杂草小飞蓬，在茶园生态系统中起着怎样的作用，对茶小绿叶蝉行为影响如何，本文拟开展小飞蓬对该虫的行为调控功能，鉴定出活性组分，明确其调控机制，探明小飞蓬在茶园生态系统中对茶小绿叶蝉的行为影响，为茶园应用“推拉”策略调控该虫提供材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

茶小绿叶蝉：2016年5月中旬于福建省农业科学院茶叶研究所2号山基地采含有茶小绿叶蝉卵的茶梢，室内水培饲养，取大小均匀3～4龄若虫，饥饿1 h，备用。标准单体化合物信息如下表1，挥发物单体以液体石蜡为溶剂，配制10-5mL·mL-1、10-3mL·mL-1和10-1mL·mL-1三种剂量。

表1 标准化合物及CAS登录号、纯度和密度

1.2 试验方法

1.2.1 茶小绿叶蝉高龄若虫对小飞蓬挥发物的趋性行为测定 参照钮羽群等[7]方法，取小飞蓬植物植株为味源材料，用“Y”型嗅觉仪测定茶小绿叶蝉若虫对小飞蓬植物挥发物的趋性反应。“Y”型管A、B两臂用直径为1.0 cm Teflon 管分别连接小飞蓬植物植株和对照(洁净空气)后再连接气泵。开启气泵后，调整流量计使气流以 100 mL·min-1的平稳流速通过每个味源进入“Y”型管两臂。气流进入气味源前需通过活性炭过滤器过滤和洗瓶加湿，嗅觉仪置于暗箱内。由释放管管口将20头若虫放至“Y”型管基部观察。当若虫处于释放管1/2 处开始计时，当虫越过 A 或 B 臂 1/2 处且停留 1min 以上时，记为作出选择反应；当放入 20 min 后无明显选择趋向，记为无反应。每头若虫只测试 1 次，每测试 20 头，将“Y”型管两臂互调方向，以消除位置引起的误差，每日测定完毕后，用乙醇清洗“Y”型管及连接 Teflon 管并放于 100℃烘箱中烘烤 2 h。设小飞蓬剂量5，10，15，20，25 g共5个剂量，每个剂量重复4次。每个剂量测试完后，将“Y”形管、味源瓶、对照瓶和加湿瓶酒精清洗，100℃烘箱烘干，活性炭置于100℃烘箱内活化4 h 解吸附，清除吸附的气体，备用。

1.2.2 小飞蓬挥发物的提取鉴定 ①固相微萃取法(SPM)提取挥发物。剪取50 g小飞蓬嫩茎放入1000 mL的广口瓶中，橡胶塞封口。橡胶塞上端插入SPME，推出纤维头，不要使萃取头碰到植物叶片，收集植物挥发物，分别收集1 h，每个试验重复8次。试验完毕后，抽回纤维头，拔出萃取头，于230℃解析10 min，同时启动气质仪器采集数据，微萃取头为PDM和DVB。②挥发物组分鉴定(GC-MS)。应用气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术对提取的挥发物质进行成分和含量分析，采用保留指数定性法和质谱图库对照法进行定性，面积归一化法进行各成分的相对定量。待选植物挥发物的气相色谱-质谱条件：50℃ 用于5 min然后 3.5 ℃·min-1到141 ℃然后2℃·min-1到 170℃，然后 3.5 ℃·min-1到230 ℃保持 5 min。

1.2.3 茶小绿叶蝉若虫对小飞蓬挥发物单体的选择行为 方法同1.1，挥发物单体以液体石蜡为溶剂，配制10-5mL·mL-1、10-3mL·mL-1和10-1mL·mL-1三种剂量。吸取100 μL每种剂量的溶液作为味源，再吸取液体石蜡100 μL作为CK，于室内做行为测定。

1.3 数据统计分析

利用Microsoft excel和 DPS软件进行统计分析，茶小绿叶蝉趋性反应应用卡方检验进行显著性差异检测，无选择行为的成虫不计入统计分析。趋避=[(对照边虫数-处理边虫数)/对照边虫数]×100

2 结果与分析

2.1 茶小绿叶蝉若虫对小飞蓬挥发物的趋性行为测定

小飞蓬嫩茎挥发物在5 g至25 g范围内对茶小叶蝉的若虫的趋性选择具有一定规律性，相对小飞蓬挥发物气味，茶小绿叶蝉显著趋向空气对照，茶小绿叶蝉选择率总体不超过31.82%，叶蝉的选择率伴随小飞蓬质量的增加而呈现先降低后升高状态，在小飞蓬15 g，选择率最低为17.39%，其趋避作用随着剂量的增加呈现先升高后降低，在小飞蓬15 g时，对茶小绿叶蝉趋避作用最大，为78.95%，以小飞蓬剂量为自变量，以对叶蝉趋避率为因变量，两者作用的抛物线关系，即y=-0.1662x2+5.2914x+33.704，R2=0.7434(P<0.05)。

表2 不同剂量的小飞蓬植物挥发物对叶蝉的趋避活性

2.2 小飞蓬挥发物的提取鉴定

小飞蓬挥发物中鉴定出47种挥发物质，其中DVB萃取45种，PDM柱萃取挥发物33种，其物质为醇类，酮类，醛类和烯类，其中醇类物质为叶醇，相对含量为0.07%，醛类相对含量为0.20%，分别是葵醛和椰子醛，酮类物质仅鉴定出樟脑(0.04%)，小飞蓬主要挥发物为烯类，相对含量约为99.69%，相对含量前4的物质分别D-柠檬烯，(E)-β-金合欢烯、β-荜澄茄油烯和β-石竹烯，在DVB萃取中分别含31.45%、13.16%、7.64%和7.3%，在PDM柱萃取挥发物中分别16.5%、12.57%、20.45%和11.16%。仅出现在在DVB萃取的挥发物15种，而PDM萃取中仅出现两种白菖油萜和顺式-α-红没药烯。

表3 小飞蓬挥发物各组分

(续表3)

峰号保留时间(min)化合物相对含量(%)DVBPDM1226.17γ-芹子烯 gamma.-Selinene 0.26ND1326.32α-荜澄茄油烯 alpha.-Cubebene 0.400.121426.89椰子醛2(3H)-Furanone, dihydro-5-pentyl-0.050.081527.12依兰烯Ylangene 0.21ND1627.31α-可巴烯 (-)-Copaene0.850.141727.64α-波旁烯 alpha.-Bourbonene2.561.391827.83大根香叶烯Germacrene D0.070.741927.96β-榄香烯beta.-Elemene0.852.022028.48(Z)-石竹烯 (Z)-Caryophyllene0.16ND2128.57(-)-α-古芸烯(-)-.alpha.-Gurjunene0.05ND2229.10β-石竹烯 β-Caryophyllene7.3011.162329.23甘香烯Elixene0.470.192429.38(+) -表二环倍半水芹烯(+)-Epi-bicyclosesquiphellandrene1.241.612529.51反式-α-香柠檬烯Trans-.alpha.-Bergamotene2.092.512629.5910s,11s-Himachala-3(12),4-diene5.442.532729.94(-)-β-檀香烯(-)-.beta.-Santalene0.571.132830.15葎草烯.alpha.-Caryophyllene1.591.502930.34香树烯(-)-Alloaromadendrene1.28ND3030.40(E)-β-金合欢烯(E)-.beta.-Farnesene13.1612.573131.08β-荜澄茄油烯.beta.-Cubebene0.67ND3231.55γ-摩勒烯gamma.-Muurolene7.6420.453331.62白菖油萜(+)-Calarene ND0.533431.16α-雪松烯.alpha.-Himachalene0.62ND3531.66双环大牻牛儿烯Bicyclogermacrene2.548.413631.78α-衣兰油烯.alpha.-Muurolene0.570.623732.00愈创木烯 beta.-Guaiene0.87ND3832.09α-法尼烯.alpha.-Farnesene0.301.223932.264,9-己二烯4,9-Cadinadiene1.250.204032.35β-雪松烯.beta.-Himachalene0.050.214132.63d-杜松萜烯.delta.-Cadinene2.901.864232.921,4-己二烯1,4-Cadinadiene0.290.11

注：ND表示未检测出此物。

2.3 茶小绿叶蝉高龄若虫对小飞蓬挥发物单体的选择行为

通过“Y”型嗅觉仪，测定小飞蓬10种主要挥发物对茶小绿叶蝉的行为影响，X2检验结果表明，在10-3和10-5mL·mL-1，β-蒎烯对茶小绿叶蝉具有显著趋避作用，β-石竹烯在10-3mL·mL-1浓度下对茶小绿叶蝉具有显著趋避作用，而红没药烯在10-1mL·mL-1下对茶小绿叶蝉具有显著引诱作用。

3 讨论

小飞蓬为茶园主要杂草，隶属菊科植物，具有特殊气味，通过Y型嗅觉仪测定茶小绿叶蝉对小飞蓬植物挥发物的趋性反应，结果表明，相对于空气，茶小叶蝉高龄若虫对小飞蓬具明显的趋避作用，初次探讨茶园杂草小飞蓬植物挥发物对茶小绿叶蝉行为影响，而非茶园植物万寿菊植物挥发物对叶蝉高龄若虫具有类似的趋避效果[9]，同时茶园菊科杂草精油胜红蓟AgeratumconyzoidesL、金腰箭rellanodiflora和假臭草Praxelisclematidea(Griseb.) R. M. King et H. Rob.3种挥发油对茶小绿叶蝉成虫具较强的趋避作用[10]。虽叶蝉类的成若虫感受器基本一致，但还要进步证明茶小叶蝉成虫对小飞蓬挥发物的选择行为。

图1 DVB提取小飞蓬挥发物离子流量图Fig.1 Total ion flow chromatography of volatiles extracted by DVB from C. Canadensis

图2 PDM提取小飞蓬挥发物离子流量图Fig.2 Total ion flow chromatography of volatiles extracted by PDM from C. Canadensis

表4 茶小绿叶蝉对10种挥发物组分的选择行为

注：*表示卡方检验显著，**表示卡方检验极显著；*P< 0.05 (χ2-test),**P<0.01(χ2-test)

通过“Y”型嗅觉仪确定了小飞蓬挥发物10种的主要成分对茶小绿叶蝉若虫的行为影响，10-3和10-5mL·mL-1的β-蒎烯，对茶小绿叶蝉具有极显著趋避作用，而钮羽群以类似的方法测定在10-10g·mL-1呈现显著趋避性，表明β-蒎烯作为茶小绿叶蝉的趋避物质，趋避性与浓度相关，β-石竹烯在10-3mL·mL-1浓度下对茶小绿叶蝉具有显著趋避作用而在1 g·mL-1时趋避作用不显著[11]，红没药烯在10-1mL·mL-1下对茶小绿叶蝉具有显著引诱作用。昆虫是利用视觉与嗅觉搜寻，并发现寄主的，而嗅觉信号的气味在空气中的传播受到风速、温湿度等非生物因素的影响，而室内试验中气味受空气的传播影响的生物因素较少，所以需要对叶蝉若虫具有趋避作用的物质β-蒎烯和β-石竹烯和引诱物质红没药烯进一步的田间试验验证。

由于产地、时间、品种和提取方法的不同，获得某种植物挥发物(香精油)的质和量会有差异。但本文使用的是固相微萃取提取法，吸附的小飞蓬鲜叶挥发物同时拥有两种水蒸馏法提取的小飞蓬精油主要成分[12-13]，说明了本方法具有可行性。