马克斯克鲁维酵母生物转化2-苯乙醇工艺优化及耐高温特性分析

牛明福，李亚恒，陈金帅，李阳

1(河南科技大学 食品与生物工程学院，河南 洛阳，471023) 2(洛阳市微生物发酵工程技术研究中心，河南 洛阳，471023) 3(河南科技大学，微生物资源开发与利用重点实验室，河南 洛阳，471023)

2-苯乙醇(2-phenylethanol，2-PE)又称β-苯乙醇，是一种具有柔和而持久玫瑰香气的芳香醇，广泛应用于日化和食用香精中[1-2]。目前主要采用化学合成或从天然物中提取获得该成分。化学合成2-苯乙醇虽已步入工业化生产阶段，但其产物中存在诸多复杂且难以除去的副产物，如氯乙醇、邻氯乙苯、联苯等副产物，并伴随刺激性气味，严重危害人体健康。许多芳香植物如玫瑰、茉莉、风信子等的精油中含有2-苯乙醇，但含量极低，从中提取的2-苯乙醇不仅价格昂贵，且难以满足市场需求[3-4]。因此，通过微生物发酵法生产天然2-苯乙醇得到了国内外研究人员的广泛关注[5]。

多种酵母具有合成2-苯乙醇的能力，如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、毕赤酵母(Pichiasp.)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)及异常汉逊酵母(Hansenulaanomala)等[6]，主要通过艾氏途径(Ehrlich pathway)，将L-苯丙氨酸转化成2-苯乙醇[7-8]。限制酵母转化合成2-苯乙醇能力的因素有两方面：一方面是发酵过程中存在严重的产物抑制效应，这是影响2-苯乙醇产量的主要瓶颈之一[9]；另一方面，为了控制因发酵产热造成的温度上升，需要安装控温装置，导致生产成本增加[10]。因此，筛选2-苯乙醇耐受性能较好且具有耐高温能力的优质菌株是实现生物转化2-苯乙醇工业化生产的关键。在前期研究中，本课题组筛选出1株耐高温且2-苯乙醇耐受性良好的马克斯克鲁维酵母LY1菌株，其最适生长温度为37 ℃，在基础转化培养基中发酵2-苯乙醇的产量为0.96 g/L。马克斯克鲁维酵母是一种具有可利用底物广泛、生长速率较快等优势的耐高温酵母[11]。本试验通过单因素与响应面分析，探讨主要培养基成分对酵母合成2-苯乙醇的影响，得到较优的培养基组成，并研究LY1菌株在高温条件下的发酵性能。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

马克斯克鲁维酵母LY1菌株、酿酒酵母AC菌株：由河南科技大学微生物基因工程研究室分离鉴定。

1.1.2 培养基

固体YPD培养基(g/L)：葡萄糖 20.0，蛋白胨 20.0，酵母浸粉 10.0，琼脂粉 20.0，自然pH值。

液体种子培养基(g/L)：葡萄糖 20.0，蛋白胨 20.0，酵母浸粉 10.0，自然pH值。

基础转化培养基(g/L)：葡萄糖 60.0，蛋白胨 6.0，MgSO40.5，KH2PO45.0，L-苯丙氨酸 6.0，自然pH值。

1.1.3 主要试剂

L-苯丙氨酸：生工生物公司(上海)股份有限公司，纯度98.5%；2-苯乙醇标准品：生工生物公司(上海)股份有限公司，纯度98.0%；甲醇：西陇化工股份有限公司，色谱纯。

1.2 主要设备

恒温组合式摇床(HYL-C2),太仓市强乐实验设备有限公司；高效液相色谱仪(1260 Infiity),美国安捷伦科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 种子液的制备

将保种管中的酵母菌划线接入固体YPD培养基，于28 ℃培养48 h。从培养皿挑取1环单菌落至5 mL种子培养基中，于28 ℃、200 r/min振荡培养24 h。

1.3.2 2-苯乙醇的转化合成

将种子液按10%接种量接种于转化培养基，28 ℃条件下200 r/min振荡培养48 h。

1.3.3 2-苯乙醇的检验方法

采用反相高效液相色谱法测定2-苯乙醇的产量[12]，转化培养48 h后，发酵液经12 000 r/min离心10 min，小心吸取上清，用0.22 μm有机系滤膜过滤。HPLC检测条件为：Venusil MP C18色谱柱(4.6 mm×250 mm)，进样量10 μL，流动相为(甲醇)∶(水)=6∶4，流速0.6 mL/min，柱温30 ℃，检测波长260 nm，检测时间12 min。

1.3.4 单因素试验

以2-苯乙醇产量为指标，分别考察转化培养基主要成分对2-苯乙醇合成的影响，包括L-苯丙氨酸添加量、碳源种类及添加量、氮源种类及添加量[13]。各项添加水平如下：

L-苯丙氨酸：0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 g/L；

不同种类碳源：葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、菊粉、乳糖、甘油均为60.0 g/L；

碳源：20.0、40.0、60.0、80.0、100.0、120.0 g/L；

不同种类氮源：酵母浸粉、蛋白胨、尿素、硫酸铵均为6.0 g/L；

氮源：0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 g/L。

1.3.5 响应面优化试验设计

在单因素试验的基础上，选取3个自变量，以2-苯乙醇产量为响应值，采用Box-Behnken设计方法对培养基成分进行三因素三水平响应面分析试验，利用Design-Expert软件进行数据处理和回归分析[14]。

1.3.6 耐受性试验

用无菌水将种子液稀释，吸取200 μL均匀涂布于含不同质量浓度2-苯乙醇(0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 g/L)的固体培养基上，分别置于28、36、42 ℃恒温培养箱中培养72 h，计算长出的酵母菌落数。

1.3.7 高温发酵试验

将种子液接种到优化后的转化培养基中，分别在28、30、32、34、36、38、40、42 ℃条件下进行发酵，测定发酵液中2-苯乙醇的质量浓度。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1L-苯丙氨酸添加量对2-苯乙醇合成的影响

艾氏途径中，L-苯丙氨酸作为底物参与2-苯乙醇的合成。L-苯丙氨酸添加量对2-苯乙醇合成的影响如图1所示，当L-苯丙氨酸质量浓度范围在0～6 g/L时，2-苯乙醇产量增加幅度较大，L-苯丙氨酸添加量超过8.0 g/L时，2-苯乙醇产量基本稳定，但底物质量浓度的增加会使转化率呈下降趋势[15]，造成原料利用率降低。因此，L-苯丙氨酸最佳添加量应为8 g/L。

图1 L-苯丙氨酸添加量对转化2-苯乙醇的影响Fig.1 Effects of L-Phe dosage on 2-PE production

2.1.2 碳源种类对2-苯乙醇合成的影响

马克斯克鲁维酵母可以产生菊粉酶、乳糖酶等水解酶，与其他酵母相比可利用的底物较广泛[16]。碳源种类对2-苯乙醇合成的影响如图2所示，LY1菌株能够较好地利用葡萄糖和蔗糖作为碳源，以供生物转化2-苯乙醇，亦能利用菊粉，但以麦芽糖、乳糖、甘油作为碳源的2-苯乙醇产量较低。因此，选择产量最高且成本较低的蔗糖作为碳源进行后续试验。

图2 不同碳源对转化2-苯乙醇的影响Fig.2 Effects of carbon sources on 2-PE production

2.1.3 碳源添加量对2-苯乙醇合成的影响

以蔗糖作为碳源，考察不同添加量对转化2-苯乙醇的影响，结果见图3。蔗糖质量浓度在20.0～40.0 g/L范围内时，随着蔗糖添加量的增加，2-苯乙醇产量显著提高。但随着蔗糖的继续添加，2-苯乙醇产量呈下降趋势，说明在高糖环境下，酵母细胞内外渗透压的差异影响了菌体的正常生长，导致2-苯乙醇产量下降。因此，确定蔗糖的最佳添加量是40.0 g/L。

图3 蔗糖添加量对转化2-苯乙醇的影响Fig.3 Effect of sucrose dosage on 2-PE production

2.1.4 氮源种类对2-苯乙醇合成的影响

氮源分为有机氮和无机氮，选择酵母浸粉、蛋白胨、尿素、(NH4)2SO44种常用氮源[17]，分别考察添加不同氮源和不添加氮源(仅以L-苯丙氨酸作为唯一氮源)对LY1菌株转化2-苯乙醇的影响，结果如图4所示。

图4 不同氮源对转化2-苯乙醇的影响Fig.4 Effects of nitrogen sources on 2-PE production

酵母浸粉或蛋白胨作为氮源以供酵母利用时，转化2-苯乙醇的效果高于尿素和(NH4)2SO4，说明LY1菌株利用有机氮的能力高于无机氮。当L-苯丙氨酸作为唯一氮源时，2-苯乙醇转化效果并不理想，是因为L-苯丙氨酸作为氮源不能满足酵母正常生长需求，导致菌体活性不高，转化2-苯乙醇的能力也随之下降。因此，选择酵母浸粉作为转化氮源以供后续试验。

2.1.5 氮源添加量对2-苯乙醇合成的影响

以酵母浸粉为氮源，考察氮源添加量对2-苯乙醇合成的影响，结果见图5。随着酵母浸粉添加量的增加，2-苯乙醇产量呈上升趋势，当酵母浸粉质量浓度超过6.0 g/L时，2-苯乙醇产量略有下降。说明添加适量的氮源有利于2-苯乙醇的合成，氮源过量对转化2-苯乙醇的效果并不明显。当培养基中酵母浸粉质量浓度超过10.0 g/L时，高效液相色谱的结果会受到酵母浸粉的影响，无法检测2-苯乙醇产量。因此，确定酵母浸粉的最佳添加量是6.0 g/L。

图5 酵母浸粉添加量对转化2-苯乙醇的影响Fig.5 Effect of yeast extracts dosage on 2-PE production

2.2 响应面分析试验结果

综合单因素试验结果，选取L-苯丙氨酸添加量(A)、蔗糖添加量(B)、酵母浸粉添加量(C)作为3个自变量，以2-苯乙醇产量作为响应值，设计三因素三水平响应面分析试验，考察3种培养基成分与2-苯乙醇合成之间的关系。试验设计方案与结果见表1。

对表1中的数据进行逐步回归拟合，得到如下回归方程：Y=1.44+3.125E-003A+0.018B+0.054C+2.000E-003AB-7.500E-004AC-2.500E-003BC-8.125E-003A2-0.054B2-0.079C2，其响应值与自变量之间呈线性关系且较为显著(P>F=0.000 1，线性相关系数R2=0.989 6)，该方程可用于分析和预测2-苯乙醇的产量。

根据回归方程得到最优培养基组成为：L-苯丙氨酸8.39 g/L，蔗糖43.25 g/L，酵母浸粉6.68 g/L，预测2-苯乙醇的产量为1.448 g/L。为证实预测结果，用以上配方重复试验3次，得2-苯乙醇平均产量为1.450 g/L，实验值与预测值拟合性良好。

表1 响应面试验设计及响应值Table 1 Experimental design and correspondingresponse value

2.3 因素间的交互影响

对响应面试验进行方差分析，回归方程的交互项中只有BC项显著(p=0.047 3)，其余交互项均不显著。说明蔗糖与酵母浸粉添加量对2-苯乙醇合成的影响显著，而L-苯丙氨酸添加量对其影响不显著。响应面回归方程拟合绘制响应面图形，如图6。

图6 蔗糖与酵母浸粉影响2-苯乙醇产量的响应面和等高线Fig.6 Response surface and contour of the effect on 2-PE production by saccharose and yeast extracts

图6-a是以蔗糖与酵母浸粉添加量为变量生成的响应面图，两者添加量的增加均会使2-苯乙醇产量增大，过量的蔗糖与酵母浸粉不利于2-苯乙醇的生物合成。图6-b中等高线的形状可以反映交互效应的强弱，等高线图成椭圆形，说明两因素之间交互作用显著，对2-苯乙醇合成的影响较大。

2.4 耐受性试验结果

一般酵母菌的最适生长温度在28 ℃左右，而马克斯克鲁维酵母是一种耐高温酵母，可以在42 ℃的高温条件下进行发酵。将酵母菌涂布于含有不同质量浓度2-苯乙醇的固体培养基中，在28～42 ℃培养，考察高温对酵母细胞耐受2-苯乙醇的影响，结果如表2所示。

表2 不同温度下2-苯乙醇耐受性结果Table 2 The tolerance of 2-PE under different temperatures

注：+表示生长状况；-表示征耐受极限；×表示完全不生长。

当培养温度为28 ℃时，马克斯克鲁维酵母LY1菌株和酿酒酵母AC菌株的最高2-苯乙醇耐受质量浓度均为2.5 g/L。2-苯乙醇添加量过高会抑制酵母的生长繁殖[18]，随着培养温度升高和2-苯乙醇质量浓度的增加，酵母菌落数不断减少表明：高温和2-苯乙醇的联合胁迫作用导致LY1菌株的2-苯乙醇耐受能力降低，37 ℃时的耐受质量浓度为2.0 g/L，且42 ℃时的耐受质量浓度仍为1.5 g/L。然而，酿酒酵母AC菌株的耐受能力较差，42 ℃时仅高温胁迫已完全抑制其正常生长，在37 ℃时虽能正常生长但2-苯乙醇耐受质量浓度几乎为0 g/L。说明马克斯克鲁维酵母具有较强的高温和2-苯乙醇耐受能力，且具有很大的高温发酵2-苯乙醇的潜力。

2.5 高温发酵试验结果

将种子液接种到上述优化后的转化培养基中，在28～42 ℃温度范围内进行发酵，考察高温对LY1菌株转化2-苯乙醇的影响，确定最适发酵温度，结果如图7所示。发酵温度在28～32 ℃范围内时，2-苯乙醇产量较高且稳定，说明LY1菌株转化2-苯乙醇的最佳温度范围在28～32 ℃。随着温度的继续上升，2-苯乙醇产量逐渐下降，在42 ℃时，2-苯乙醇产量为0.809 g/L，说明LY1菌株高温发酵能力较强，在42 ℃高温环境下仍具有一定转化2-苯乙醇的能力。

图7 发酵温度对转化2-苯乙醇的影响Fig.7 Effect of fermentation temperature on 2-PE production

目前，国内外有关温度对酵母转化2-苯乙醇影响的报道较少。黄筱萍等[15]研究了不同转化温度对酿酒酵母SH003合成2-苯乙醇的影响，其最适转化温度为28～30 ℃，低于26 ℃和高于32 ℃产物浓度明显下降。明红梅等[19]研究了温度对传统浓香型大曲中分离筛选的异常威克汉姆酵母菌株J7发酵生产2-苯乙醇的影响，发现在33 ℃下发酵时，2-苯乙醇产量最高，并采用响应面法对发酵条件进行优化，当发酵温度为35 ℃时，2-苯乙醇产量为63.50 mg/kg。通常酵母菌转化2-苯乙醇的发酵温度为28～30 ℃，而耐高温酵母可以在35 ℃以上合成2-苯乙醇。ETSCHMANN等[20]筛选出的耐热性马克斯克鲁维酵母CBS600菌株在35 ℃条件下，在以糖蜜为碳源的合成培养基中发酵41 h后，2-苯乙醇终产量达到0.89 g/L。ESHKOL等[21]从耐热酿酒酵母菌株Ye9系列中筛选到了1株能够耐受2.5 g/L以上2-苯乙醇的Ye9-612，30 ℃发酵72 h后，产量达到0.85 g/L。LY1菌株与其他耐高温菌株相比，在35 ℃以上高温条件下具有更强的2-苯乙醇发酵能力。LY1菌株的最适生长温度为37 ℃，而其2-苯乙醇的最适转化温度低于最适生长温度可能与2-苯乙醇合成的相关酶的活性及稳定性有关[19]。对比耐受性试验结果，LY1菌株在36 ℃时的2-苯乙醇产量远低于耐受极限，其高温发酵2-苯乙醇的产量仍具有较大的提升空间。

3 结论

微生物转化合成2-苯乙醇具有成本低、产品质量高等优点，已受到广泛关注。如何提高微生物转化合成2-苯乙醇的产量是近年来的研究重点之一。发酵培养基成分及培养条件能很大程度上影响酵母细胞生产2-苯乙醇的产量。本研究通过单因素试验筛选出合适的转化碳源和氮源，并对主要培养基成分的添加量进行响应面分析，优化后的结果为：L-苯丙氨酸8.39 g/L，蔗糖43.25 g/L，酵母浸粉6.68 g/L。在优化后的转化培养基中发酵48 h后，2-苯乙醇产量可达到1.450 g/L，较优化前提高了51.0 %。与其他耐高温菌株相比，LY1菌株在35 ℃以上具有更强的2-苯乙醇发酵能力，且在42 ℃高温条件下仍具有一定的2-苯乙醇耐受和发酵能力，后续研究可从基因改造方向入手[22]，提高其高温和2-苯乙醇耐受性能，进一步提高转化2-苯乙醇的能力。

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