基于甾体皂苷的襄麦冬块根抑制性差减杂交文库的构建

余海忠，王海燕，赵慧君，孙永林

(湖北文理学院化学工程与食品科学学院，湖北 襄阳 441053)

【研究意义】襄麦冬Liriopespicatavar.proliferaY. T. Ma，百合科山麦冬属植物，是《中华人民共和国药典》收录的山麦冬基原植物之一，其块根与川麦冬、杭麦冬一样，中药处方均作麦冬同等入药[1]。甾体皂苷是襄麦冬的主要活性成分之一，具有降血糖、增强免疫、抗肿瘤、防治心血管疾病、调节免疫力等多种活性[2-4]。但是，由于受到诸如种植面积、气候条件、生长周期等因素影响，尤其是较低的含量水平，襄麦冬甾体皂苷的可持续利用受到了一定的制约。【本研究切入点】研究表明，皂苷类成分的含量及组成，不仅随植物遗传背景、组织类型、生长年龄、生理状况、环境因子的改变而发生显著变化，而且还取决于皂苷合成酶及其表达水平[5]。由于襄麦冬甾体皂苷的含量变化，具有明显的生长发育阶段特性[6]，提示与其相关的合成酶，在块根生长发育阶段进行了差异性表达，这为实验室进行差异基因的筛选提供了理论可能。【前人研究进展】在寻找与某一性状相关的基因时，抑制消减杂交(SSH)技术被认为是一种较为适合的常规技术，可在转录水平上发现两样品间差异表达的基因[7]。利用该技术，国内学者开展了一些与产苷调控基因筛选相关的基础工作。和凤美[8]构建了三七1年和3年生根cDNA的抑制消减文库，用于寻找三七皂苷调控基因。罗志勇[9-10]通过SSH文库鉴定出6个克隆(基因)在人参植物根生长发育阶段差异表达。唐其[11]构建了罗汉果果实在不同生育时期皂苷生物合成相关基因的差减cDNA文库，为提高罗汉果甜苷V的质量和产量奠定了基础。王士杰[12]以茉莉酸甲酯诱导组与对照组人参发根为材料构建SSH文库，获得了诱导下的差异表达基因。【拟解决的关键问题】本实验以始见期和采收期块根为材料，构建襄麦冬不同生育期块根的抑制性差减杂交文库，以期能筛出一些参与甾体皂苷合成的酶或蛋白，为实现体外调控提高甾体皂苷含量提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 襄麦冬块根

块根样品分2次采集，第1次是2012年9月7日(始见期)，第2次是2013年3月12日(采收期)，均采自湖北襄阳欧庙襄麦冬GAP生产基地，整株带土移栽于盆中迅速带回实验室，自来水和ddH2O大量冲洗后，块根用灭菌滤纸蘸干，快速切下后用液氮速冻，置-80 ℃保存备用。

1.2 试剂和耗材

PCR-Select cDNA Subtraction Kit、Advantage 2 Polymerase Mix，购自Clontech公司；QIAquick PCR Purification Kit，购自Qiagen公司；Taq酶、标准分子量、pMDl9-T载体购自TaKaRa公司；大肠杆菌(Escherichiacoli) DH5α购自上海生工；CTAB、LiCl、SSTE、DEPC、琼脂糖、胰蛋白胨、酵母粉、NaCl、NaOH、氨苄青霉素、Tris饱和酚、氯仿、乙醇、异戊醇、异丙醇等，购自国药(上海)集团公司；各型号tip、离心管等，购置Axygen公司。

1.3 主要设备

SIGMA 3K15冷冻离心机，ABI 9700 PCR仪，Bio-Rad Power Pac HCTM电泳仪，Bio-Rad GelDoc XR凝胶成像仪，HZ-9211K恒温振荡器，GHP-9050隔水培养箱，SW-CJ-1FD超净工作台，DK-8D三孔电热恒温水槽，New Bruns-wick scientific U41086超低温冰箱，Thermo Nano Drop 2000紫外分光光度计。

1.4 SSH文库构建

采用CTAB法和QIAquick PCR Purification Kit，完成襄麦冬块根总RNA的提取与纯化，经质量检测后，总RNA用于下一步的实验。RNA的反转录及双链DNA的合成参照SMART PCR cDNA Synthesis Kit进行。以襄麦冬始见期块根cDNA为参照样品，以采收期块根cDNA为检测样品，按照ClontechTMPCR-Select cDNA Subtraction Kit说明，进行抑制差减杂交操作。SSH产物纯化后，与pMD19-T载体连接过夜，转化E.coliDH5α感受态细胞，采用蓝白斑筛选阳性克隆，随机挑取24个白色克隆进行Nested PCR以进一步鉴定阳性克隆。实验中用到的引物和接头序列见表1。

表1 引物和接头序列Table 1 The sequences of primers and adaptor

表2 襄麦冬块根总RNA的分光光度检测结果Table 2 The results of pectrophotometric detection of total RNA from L. spicata var. prolifera

1.5 EST序列分析

从文库中随机选取400个阳性克隆，经活化培养后提取质粒DNA，送上海生工测序。对EST序列进行Blast分析，利用Interproscan、COG、GO、KEGG等数据库进行功能注释和归类。

2 结果与分析

2.1 总RNA质量检测

襄麦冬块根总RNA经紫外分光光度计检测，得到始见期块根的总RNA样品OD260/OD280为2.1，采收期块根的为2.2(表2)，表明RNA的纯度较高，可用于后续反转录的模板。

由图1可知，28S和18S rRNA条带清晰、无弥散，表明提取的总RNA完整、无降解。同时，28S大约是18S条带亮度的2倍，表明二者大致2倍的密度关系。此外，28S rRNA条带上方无其它条带出现，表明RNA制备过程中无DNA污染。

SJQ：始见期样品，CSQ：采收期样品；M：标准分子量SJQ:Sample from the beginning growth stage tuber; CSQ:Sample from the harvest stage tuber; M:DNA size markers图1 襄麦冬块根总RNA电泳图Fig.1 The total RNA electrophoretogram of L. spicata var. prolifera

2.2 SMART反转录

利用SMART(Switching Mechanism At 5 end of the RNA Transcript)技术合成cDNA，扩增循环数过低，cDNA表达丰度也过低，循环数过高，则会有非特异扩增，造成假阳性[13]。因此很有必要对合成的循环数进行优化。如图2所示，始见期样品在第21个循环时显示扩增效率降低，故采用18个循环进行cDNA扩增；而采收期样品在第18个循环时显示低扩增效率，所以采用21个循环进行cDNA扩增。

2.3 酶切效率的检测

RsaI酶能将双链cDNA 酶切成较小的cDNA片段，以降低杂交过程中形成的复杂二级结构对杂交的阻碍作用，既能提高不同基因的检出率，又可防止长cDNA片段对消减杂交的干扰。取上述始见期和采收期块根双链cDNA片段，分别进行RsaI酶酶切，电泳检测酶切结果。由图3可知，酶切前，电泳条带呈明显的弥散状，片段大小主要集中在500～3000 bp。而酶切后，双链cDNA分布范围明显下移，片段被切成100～1000 bp多个小片段cDNA，这表明RsaⅠ已将较长的双链cDNA消化成小片段，酶切比较充分，酶切效率较好，达到了实验预期，确保了后续实验操作的准确性。

SJQ：始见期样品，CSQ：采收期样品；泳道1,4：15个循环，泳道2,5：18个循环，泳道3,6：21个循环；M：标准分子量SJQ:Sample from the beginning growth stage tuber; CSQ:Sample from the harvest stage tuber. Lane 1 and 4, lane 2 and 5, lane 3 and 6 represent 15, 18, 21 cycles respectively. M:DNA size markers图2 PCR循环数优化Fig.2 The optimization experiment of PCR cycle parameter

SJQ：始见期样品，CSQ：采收期样品；泳道1,3：酶切前的片段，泳道2,4：酶切后片段；M：标准分子量SJQ:Sample from the beginning growth stage tuber; CSQ:Sample from the harvest stage tuber; Lane 1 and 3:Before Rsa I digestion; Lane 2 and 4:After Rsa I digestion; M:DNA size markers图3 Rsa I 酶切双链cDNA效率检测Fig.3 Analysis of Rsa I digestion

2.4 接头连接效率的检测

ds cDNA与接头的连接效率是决定抑制性消减杂交成败的关键步骤之一，连接效率高才能保证后面的杂交效率高，理论上，用2个特异引物和由1个特异引物与1个通用引物扩增目标片段的产物量相同，即产物亮度一致，接头连接效率达100 %。由图4可以看出，由Primer l和18S rRNA 3’ primer扩增得到片段的亮度，是由18S rRNA 3’及5’primer扩增片段亮度的50 %，说明连接效率大于25 %。

2.5 差减效率的检测

进行2轮杂交和两轮PCR以后，差异表达的基因得到了富集，由图5可以看出，差减以后去除了共有的序列，富集了差异表达的基因，因此条带亮度有所降低。同时，差减以后cDNA片段整体向下偏移(泳道1和泳道3)，说明富集的差异表达片段集中在小片段范围内，长度主要集中在250～1000 bp。此外，差减以后，条带有些区域的亮度较集中，可能是由于相似长度的差异片段得到了最大程度的富集，符合cDNA文库的构建要求。

泳道1,3：以18S rRNA两端为引物的PCR产物，泳道2,4：以Primer 1和18S-rRNA 3’端为引物的PCR产物；泳道1和2是以加接头1的样品为模板，泳道3和4是以加接头2的样品为模板；M：标准分子量Lane 1 and 3:PCR products using the primer 1 and 18S rRNA 3' primer; Lane 2 and 4:PCR products using the 18S rRNA 5' and 3' primers; Lane 1 and 2:PCR products using adaptor 1-ligated as template; Lane 3 and 4:PCR products using adaptor 2-ligated as template. M:DNA size markers图4 接头连接效率检测Fig.4 Analysis of the ligation efficiency

SJQ：始见期样品，CSQ：采收期样品；泳道1,3：以差减后产物为模板扩增的片段，泳道2,4：以差减前产物为模板扩增的片段；M：标准分子量SJQ:Sample from the beginning growth stage tuber; CSQ:Sample from the harvest stage tuber; Lane 1 and 3, PCR was performed using subtracted product as template. Lane 2 and 4:PCR was performed using unsubtracted product as template. M:DNA size markers图5 差减效率验证Fig.5 Analysis of subtraction efficiency

2.6 差减文库的PCR验证

经SSH消减并富集得到的cDNA片段，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，筛选蓝白班，分别随机挑取24个白色克隆，进行巢式PCR检测。由6图可知，大多数插入片段长度约在250～900 bp，符合建库要求。

SJQ：始见期文库，CSQ：采收期文库；泳道1～24：以随机挑选的白色克隆为模板的PCR扩增片段SJQ:Sample from the beginning growth stage tuber; CSQ:Sample from the harvest stage tuber; Lane 1-24, RCR products using the randomly selected clones as template图6 差减文库中插入片段检测Fig.6 The cDNA inserts verified by PCR

表3 样本基因与公共数据基因对比结果统计Table 3 BLAST result of ESTs with the database of NR,SWISS-PROT, TREMBL, CDD and PFAM

2.7 基因的生物信息学分析

2.7.1 基因的同源性注释 基因的同源性注释，采用BLST方法，将样本基因分别与SWISS-PROT、CDD、PFAM、NR和TREMBL公共数据库进行比对，取相似度>30 %，且e<1e-5的注释为有效注释，合并基因得到的所有注释详细信息。BLAST结果显示：能注释上NR、SWISS-PROT、TREMBL、CDD、PFAM数据库的样本基因，分别有65.26 %、34.42 %、63.96 %、26.30 %、14.94 %，具体注释上不同数据库的基因数量分布见表3。

2.7.2 基因的COG/KOG功能分类预测 对SSH文库的Unigene分别进行COG与KOG功能分类预测(图7)，结果发现有23个Unigene能被注释上12种COG分类中，包括：核苷酸运输和代谢(Nucleotide transport and metabolism)、翻译后修饰(Posttranslational modification)、蛋白质周转与陪伴(protein turnover, chaperones)、信号转导机制(Signal transduction mechanisms)、转录(Transcription)、细胞骨架(Cytoskeleton)、次生代谢产物生物合成、运输和分解代谢(Secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolism)等类群。其中，脂质运输和代谢(Lipid transport and metabolism)类群包含的基因最多，占比为17.39 %；同时，KOG功能分类预测也发现，有103个Unigene能被注释到核苷酸运输和代谢(Nucleotide transport and metabolism)、碳水化合物运输和代谢(Carbohydrate transport and metabolism)、转录(Transcription)、细胞骨架(Cytoskeleton)、次生代谢产物生物合成、运输与分解代谢(Secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolism)等19个KOG分类中。其中，25个基因归属信号转导机制(Signal transduction mechanisms)类群，占24.27 %。

A:COG;B:KOG图7 ESTs序列COG与KOG功能预测分析结果Fig.7 COG and KOG functional analysis of EST sequences from SSH library

表4 基因的KEGG注释结果统计Table 4 KEGG analysis result of ESTs from SSH library

2.7.3 基因的KEGG注释 利用KAAS对基因注释进行预测，可获得基因对应的KO号，再由KO号可将基因对应到相关的KEGG pathway上，由此，便可得基因与KEGG中酶注释的关系以及映射到pathway上的相关信息。经KEGG分析，从本实验构建的SSH文库中，筛选出81个预测基因，它们能注释到48个不同的EC号，参与到92个通路的代谢中(表4)。其中，ZB281822基因，对应酶编号为EC:2.3.1.9，能映射到13个pathway中，涉及萜类化合物骨架合成(ko00900)、脂肪酸代谢(ko00071)、酮体的合成与降解(ko00072)、缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸降解(ko00280)、赖氨酸降解(ko00310)、苯甲酸降解(ko00362)、色氨酸代谢(ko00380)、丙酮酸代谢(ko00620)、乙醛酸和二羧酸代谢 (ko00630)、丙酸代谢(ko00640)、丁酸甲酯代谢(ko00650)、固氮通路(ko00720)、双组分系统(ko02020)等通路。

2.7.4 基因的GO分类 利用Gene Ontology对构建的SSH文库EST序列进行功能注释，发现在生物过程(biological process)分类中，基因序列主要聚集于biological process、metabiolic process、cellular process、celluar metabolic process和primary metabolic process，基因个数均超过90个，其中Biological process达到338个；在细胞组成(cellular component)分类中，序列主要聚集于cell、cell part和intracellular；而在分子功能(Molecular Function)分类中，数量排在前三的基因序列依次为catalytic activity、binding、transferase activity。图8显示的是Levle2水平下的GO注释分类结果，其中catalytic activity的基因数量最多，达到124个。

甾体皂苷的生物合成，其前半部分与三萜皂苷生物合成一样，共享甲羟戊酸代谢途径，得到产物2，3-氧化鲨烯，经环阿屯醇合成酶(cycloartenol synthase，CAS)的作用形成环阿屯醇，然后再经氧化、脱羧、还原等反应得到胆固醇，最后经甾体的糖基转移酶(Steroidal Glycosyltransferase, SGT)和β-糖苷酶(26-O-beta-glucosidase)的作用下形成各种甾体皂苷[14]。对甾体皂苷合成酶的研究，早期主要集中在甾体皂苷元部分，如3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶(HMGR)、鲨烯合成酶(SQS)、环阿屯醇合成酶(CAS)等[15-17]，后来研究发现糖链结构对其生理活性影响也比较大，随后也逐渐加强了对诸如糖基转移酶[18]、糖苷酶[19]等糖酶的研究。

本实验通过对EST序列进行生物信息学分析，从SSH文库中筛选了一些与皂苷合成相关的酶或蛋白基因片段，它们分属淀粉和蔗糖代谢、二萜类化合物的生物合成、类固醇生物合成、倍半萜类和三萜生物合成、萜类化合物骨架生物合成、糖酵解等代谢途径，如β-呋喃果糖苷酶、环阿屯醇合酶、鲨烯单加氧酶、sterol 14-demethylase、UDP-glucosyl transferase 73C等，部分序列见表5。

图8 Level 2水平下的GO注释分类gene数量分布Fig.8 Level 2 functional classification of sequenced cDNAs by Gene Ontology

表5 SSH文库中部分与皂苷合成相关的ESTs生物信息学分析Table 5 Bioinformatics analysis for a few ESTs related saponin synthesis from the SSH cDNA library

3 结 论

采用抑制性差减杂交技术，本实验室构建了襄麦冬参与甾体皂苷代谢调控基因的SSH文库：始见期块根消减文库和采收期块根消减文库，有效基因序列308条，长度主要分布在250～1000 bp左右，片段平均长度586.99 bp；文库样本序列注释上NR、SWISS-PROT、TREMBL、CDD、PFAM库的基因分别有65.26 %、34.42 %、63.96 %、26.30 %、14.94 %；样本中分别有23和103个Unigene可注释上12个COG分类与19个KOG分类中；样本中有81个预测基因，可以注释到48种酶与映射到92个代谢通路上；样本基因功能在Biological Process分类中聚集于cellular process和metabiolic process，在Cellular Component主要聚集于cell、cell part和intracellular，在Molecular Function分类中主要聚集于catalytic activity、binding和transferase activity。该文库的构建，非常有助于探索和揭示甾体皂苷生物合成途径的分子基础。

4 讨 论

抑制消减杂交是建立在抑制性PCR基础上的一种高效的差减杂交技术，可使高丰度与低丰度mRNA达到均衡，起到富集稀少mRNA的作用，有利于筛选低拷贝差异表达基因[20]，可一次检出上百个差异表达基因。尽管目前已经出现了基于第二、三代测序技术的组学研究，但是笔者认为，SSH成本低、速度快的技术特点，非常适合样品差异表达基因的初步筛选和探索，可作为组学大规模筛选研究的有益补充。

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