“附子-白术”药对对破骨细胞及成骨细胞增殖、分化及活力的影响❋

程旭锋，张新峰，刘 琦，乔翠霞，赵慧朵，马书平

(1. 河南中医药大学第一附属医院，郑州 450008； 2. 河南省肿瘤医院，郑州 450008； 3.河南中医药大学，郑州 450008； 4.河南省中医药研究院，郑州 450008)

随着抗肿瘤技术的提高，癌症患者的生存时间不断延长，其发生骨转移的风险也在不断增加，如晚期乳腺癌骨转移的发生率高达65 %～75 %[1-2]。临床治疗骨转移癌的主要药物双磷酸盐、地诺单抗等，主要是通过抑制破骨活性而减轻骨吸收，并不能修复已存在的骨损伤。前期研究[3-5]发现，《金匮要略》白术附子汤及其核心药物“附子-白术”药对可抑制乳腺癌骨转移、修复骨损伤，然而其作用机理尚不清楚。本文旨在研究“附子-白术”药对对破骨细胞和成骨细胞增殖、分化及功能的影响，为“附子-白术”药对防治恶性肿瘤骨转移提供理论及实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物与材料

10只出生48 h以内的SPF级Sprague-Dawley (SD)大鼠，购自河南省实验动物中心(合格证号SCXK(豫)2010-0002)。

DMEM培养基、α-MEM培养基、胎牛血清、L-谷氨酰胺、0.25%胰蛋白酶溶液均为美国Invitrogn公司产品；β-甘油磷酸钠、 磷酸化抗坏血酸(ASAP)、 地塞米松、噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、17β-雌二醇 (17β-estradiol，E2)、1α, 25-(OH)2VitD3、Triton X-100、RANKL、M-CSF、抗酒石酸酸性磷酸酶 (TRAP) 染色试剂盒均为美国Sigma公司产品；抗酒石酸酸性磷酸酶测定试剂盒为南京建成生物工程研究所产品(批号20140805)；碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, ALP) 测定试剂盒为南京建成生物工程研究所产品(批号20140805)；附片配方颗粒(批号140321)、白术配方颗粒(批号140615)均为江阴天江药业有限公司产品。

1.2 “附子-白术”药对药液的制备

附片配方颗粒20包(每包相当于制附子3 g)、白术配方颗粒4包(每包相当于白术10 g)溶于1000 ml的DMEM培养液(含10%胎牛血清)中，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，制备成100 mg·mL-1的“附子-白术”药对溶液；采用DMEM培养液稀释，制备实验所需浓度的“附子-白术”药对溶液(1 mg·mL-1、10 mg·mL-1)。

1.3 附子白术药对对破骨细胞的影响

1.3.1 乳鼠破骨细胞制备与分组 无菌条件下迅速取出出生48 h以内SD大鼠的长骨，PBS冲洗骨髓腔，采用细胞滤网过滤细胞，采用Histopaque 1077 (Sigma)细胞分离液分离单核细胞，接种于24孔培养板中；单核细胞采用含10%的胎牛血清、50 ng/ml的RANKL和 30 ng/ml的M-CSF α-MEM 培养液培养，每2～3 d更换培养液1次，采用0.1%胶原酶和0.2%中性蛋白酶去除基质细胞；培养7 d左右，待细胞铺满70%～80%孔底时胰蛋白酶消化传代，接种于24孔培养板中，待细胞铺满孔底时进行以下实验。实验分组为对照组、药对低剂量组(1 mg·mL-1)和药对高剂量组(10 mg·mL-1)。

1.3.2 TRAP 染色阳性计数[6-7]将24孔细胞培养板中的破骨细胞按照1.3.1项分组，每组6个复孔(n=6)，培养24 h吸弃上清液，加入含/或不含各剂量药对的培养液进行干预72 h；PBS 冲洗3次，10%的甲醛固定3 min，蒸馏水冲洗，0.5% Triton X-100 37 ℃处理10 min。按抗酒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒说明书进行 TRAP染色，二甲苯透明，中性塑胶封片，显微镜下观察，计算整张玻片中TRAP阳性细胞数(N)。细胞相对抑制率=(N对照组-N给药组)/N对照组×100%。

1.3.3 破骨细胞TRAP酶活力的测定[6-7]将24孔细胞培养板中的破骨细胞按照1.3.1项分组，每组4个复孔(n=4)，培养24 h吸弃上清液，加入含/或不含各剂量药对的培养液进行干预72 h；PBS 冲洗3次，0.5% Triton X-100 裂解，然后按照抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP) 测试盒说明书进行，于酶标仪上检测530 nm处吸光度并记录数据，根据说明书计算公式换算成金氏单位(以U/L表示)。

1.4 附子白术药对对成骨细胞的影响

1.4.1 乳鼠颅骨成骨细胞的培养[6-7]与分组 无菌条件下迅速取出出生48 h以内SD乳鼠的头盖骨剪碎(约1 mm×1mm)，37 ℃条件下0.25%胰酶消化20 min，弃上清液，0.1% Ⅱ型胶原酶消化2次，每次30 min，收集并合并2次上清液，加入含10% FBS的DMEM培养液以终止消化，4 ℃温度下1000 r/min离心10 min去上清液，加入含15% FBS 的DMEM培养液制备单细胞悬液，接种于24 cm2培养皿，24 h后更换培养液，除去未贴壁的细胞，以后每3 d换液1次；培养至细胞铺满70%～80%皿底时胰蛋白酶消化传代，制备原代细胞悬液。原代细胞悬液以5×107个/L浓度接种于24 cm2培养皿，每皿12 ml，每2～3 d换液1次，待培养至细胞铺满70%～80%皿底时，胰蛋白酶消化传代(记为P1代)；将P1代细胞接种于96孔细胞培养板，待细胞铺满80% 孔底时，加入含0.1 mol/L的β-甘油磷酸钠和10-7mol/L的地塞米松及50 mg/L的ASAP培养液进行成骨诱导，同时进行细胞分组进行以下实验。实验分为对照组、药对低剂量组(1 mg·mL-1)和药对高剂量组(10 mg·mL-1)。

1.4.2 MTT法检测成骨细胞的增殖[6-8]将96孔细胞培养板中的成骨细胞按照1.4.1项分组，每组6个复孔(n=6)，培养24 h吸弃上清液，加入含/或不含各剂量药对的培养液进行干预48 h，并以全培养液(不含破骨细胞和成骨细胞)为空白对照组(培养液组)；每孔加入10 g/L的MTT溶液10 μL，继续培养4 h；吸弃各孔上清液，分别加入150 μL DMSO振荡10 min，酶标仪于570 nm波长下检测各孔吸光度(A)。相对增殖率(%)=(A给药组-A对照组)/(A对照组-A培养液组)×100%。

1.4.3 成骨细胞ALP活性的测定[6-8]将96孔细胞培养板中的成骨细胞按照1.4.1项分组，每组4个复孔(n=4)，培养24 h吸弃上清液，加入含L-抗坏血酸(50 mg/L)、β-甘油磷酸钠(10 mol/L)、地塞米松(10 μmol/L)和各剂量药对的培养液进行干预72 h；按照碱性磷酸酶试剂盒说明书进行操作，酶标仪于507 nm波长下检测各孔吸光度，根据说明书计算公式换算成金氏单位，再用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，ALP活性以U/μg表示。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 “附子-白术”对破骨细胞增殖和TRAP 活力的影响

图1显示，破骨细胞为贴壁细胞，边缘呈不规则形态，经TRAP 染色后会在酶活性部位形成不溶性棕红色染料。在显微镜下，可以清晰地看到胞浆呈棕红色、细胞核数大于 3的阳性细胞，即为破骨细胞。表1所示，“附子-白术”药对低浓度(1 mg/L)、高浓度组(10 mg/L)破骨细胞数量明显低于对照组(P<0.05，P<0.01)，细胞抑制率分别为14.28%、32.74%；与对照组比较，“附子-白术”药对组(1 mg/L、10 mg/L)TRAP活力值均显著降低(P<0.05，P<0.01)。

图1 各组破骨细胞TRAP染色

表1 各组破骨细胞增殖和TRAP酶活力结果

注：与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01

2.2 “附子-白术”对成骨细胞增殖和ALP活力的影响

表2显示，“附子-白术”药对低浓度(1 mg/L)、高浓度组(10 mg/L)在570 nm 处的吸光度值明显高于对照组(P<0.05，P<0.01)，细胞相对增殖率分别为9.09%、24.24%；与对照组比较，“附子-白术”药对组(1 mg/L、10 mg/L)ALP活力值均显著升高(P<0.01)。

表2 各组成骨细胞增殖结果

注：与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01

3 讨论

骨转移癌属于中医学“骨痹”“湿痹”等范畴，其发生发展与中医肾脾关系密切[3-5]。《素问·五脏生成》曰： “肾之合骨也，其荣在发，其主脾也。”《景岳全书》进一步指出： “脾肾不足及虚弱失调之人，多有积聚之病。”在生理上，脾与肾相互资助、相互促进，病理上脾与肾更是相互影响、互为因果。肾阳不足，不能温煦脾阳致脾阳不振；脾阳虚弱，可损及肾阳引起肾阳亦虚，二者最终均可导致脾肾阳虚，即脾与肾在病理上存在恶性循环关系，单独温肾或健脾均不能取得良好的临床疗效。因此，本课题组在既往文献及实验研究基础[3-5,9-14]上提出，乳腺癌骨转移的治疗当脾肾同调，使后天之精源源不断地化生充养先天，先天之精旺盛又能不断地滋养后天；肾阳得温，脾胃得健，骨转移癌方得以抑制。“附子-白术”药对为《金匮要略》附子白术汤的核心药物，具有温肾阳健脾、通络止痛等功效。前期研究[3-5]证实，“附子-白术”药对可抑制乳腺癌骨转移，减轻骨损伤。本研究考察“附子-白术”药对对破骨细胞和成骨细胞的影响，探讨其防治骨转移癌的机理。

正常的骨代谢需要破骨细胞介导的“骨吸收”和成骨细胞介导的“骨形成”维持动态平衡[15-16]；恶性肿瘤骨转移损伤以溶骨性损伤为主，恶性肿瘤及其分泌的细胞因子可导致破骨细胞的“骨吸收”增强，并抑制成骨细胞的“骨形成”作用减弱，从而引起溶骨性损伤。因此，抑制破骨细胞的增殖、促进成骨细胞的增殖与分化，才将有望修复溶骨性损伤[6-8]。本研究中TRAP 染色阳性细胞计数结果表明，“附子-白术”药对低、高剂量(1 mg/L和10 mg/L)能显著性抑制破骨细胞的增殖。破骨细胞来源于骨髓产生的破骨细胞前体，本实验采用培养基中所含的1α,25-(OH)2Vit D3具有诱导破骨细胞前体分化成熟的功能，因此TRAP染色的细胞数目既包括成熟的破骨细胞，也包括经诱导而来的破骨细胞，表明“附子-白术”药对可能具有抑制骨髓细胞向破骨细胞分化及破骨细胞增殖的作用。TRAP为破骨细胞分泌的特异性酶，其活力可代表破骨细胞的骨吸收能力和活性[17]。本研究发现，“附子-白术”药对低、高剂量(1 mg/L和10 mg/L)组能够显著性抑制TRAP活力，表明“附子-白术”药对可能具有抑制骨髓细胞的骨吸收能力和活性的作用。

成骨细胞由间充质干细胞发育而来，成骨细胞可分泌细胞外基质，在骨微环境下矿化为骨基质，骨基质中的成骨细胞分化成熟后可形成骨细胞[18]，促进成骨细胞增殖，有望成为治疗各种溶骨性骨损伤的有效方法。本实验发现，低、高剂量的“附子-白术”药对(1 mg/L和10 mg/L)可促进成骨细胞的增殖。ALP是成骨细胞所分泌的蛋白酶，是成骨细胞分化的特异性标志物[19]。本实验低、高剂量的“附子-白术”药对(1 mg/L和10 mg/L)可增强ALP的活性，说明其可促进成骨细胞的分化。

综上所述，本实验发现“附子-白术”药对具有抑制骨髓细胞向破骨细胞分化，并抑制破骨细胞的增殖和活性及骨吸收功能的作用，同时也能促进成骨细胞的增殖和分化，将为临床治疗恶性肿瘤骨转移提供理论和实验数据。

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