天然药物化学课程的NMR解析
——以stapfianine B NMR为例

1.遵义医学院珠海校区，广东 珠海 519041；2.云南大学化学科学与工程学院，云南 昆明 650091

1 引言

天然药物化学是高等医药院校药学及相关专业必修课程，主要讲授天然药物化学成分的理化性质、提取分离及结构鉴定，其中结构鉴定是课程的重要内容。目前，波谱学是天然产物结构鉴定的主要方法，尤其核磁共振波谱法(NMR)提供的结构信息丰富，谱图可解析性高，已成为天然产物结构鉴定的主要方法。天然产物结构类型繁多，波谱特征复杂，而波谱解析抽象难懂，结构鉴定一直是天然药物化学的课程难点，是教师不断探索的教学改革热点[1-2]。许多医学院校未设置专门的波谱解析课程，学生没有系统学习波谱解析，难以理解与掌握天然产物的结构鉴定内容。为让学生更好地学习这门课程，作者在课程中加强了结构鉴定的讲授，尤其是以科研中遇到的真实化合物的NMR综合解析为例，通过真实谱图的清晰展示与讲解，让学生更直观具体地理解与掌握相关知识，提高课程的实践性[3]。文章介绍以玉龙乌头(AconitumstapfianumHand.-Mazz.)中分离的新苯甲酰胺衍生物stapfianine B为例讲解天然药物化学的结构研究章节[4]。Stapfianine B的结构包含苯环、酰胺、酯键和酚羟基等常见基团，波谱信号明显且不复杂，非常适合作为授课内容。

2 授课内容与方式

2.11H-NMR

1H-NMR灵敏度高易测定，已应用于化学中70余年，积累数据丰富，在结构解析中非常重要。首先向学生简要介绍1H-NMR图谱，讲解氢谱提供的结构信息(图1)。氢谱横坐标为峰组位置，用化学位移(δ)表示标注于峰组上方，右边是高磁场(化学位移小)，左边是低磁场(化学位移大)。纵坐标表示吸收峰强度，可积分得到谱线积分面积(氢的数目)标注于峰组下方。1H-NMR谱中还可见峰组耦合裂分，提供耦合常数(Jin Hz)及裂分信息。

图1 Stapfianine B的1H-NMR谱

NoδHJ/HzδCNoδHJ/HzδC2134.4s1'115.3s1117.1s2'162.2s67.54d(2.4)117.2d3'7.01d(8.4)118.8d5151.4s4'7.43t(7.6)134.6d47.11dd(8.8,2.4)122.2d5'6.96t(7.6)119.4d38.63d(8.8)122.7d6'7.76d(8.0)126.2d7168.9s7'168.8sOCH3-73.95s52.9qNH-11.94sOH-2'12.34s

2.1.1 峰面积1H-NMR谱中氢的峰面积与相同化学环境的氢数目成正比。一般用甲基信号为标准计算各组峰质子数，如stapfianine B可用甲氧基信号(δH3.95 s, 3H)为计算各峰组质子数[5]。

2.1.2 化学位移 化学位移表征官能团出峰位置，其数值大小取决于氢原子核外电子云密度，电子云密度越大化学位移值越小，谱峰越位于氢谱右方，反之亦然。任何使化学位移数值减小的作用称为屏蔽效应，使化学位移数值增大作用称为去屏蔽效应。学生应掌握影响化学位移的主要因素：诱导效应、共轭效应、各向异性效应、van der Waals效应和氢键效应。

①诱导效应指电负性取代基使氢核外电子云密度降低，去屏蔽效应增大，化学位移增大(吸收峰左移)。如甲基(RCH3)约δH0.8，由于诱导效应甲氧基低场位移至δH3.2～4.0，stapfianine B中OCH3-7(δH3.95 s)。此外应向学生讲解电负性取代带来其他影响，如常见官能团电负性均大于氢的，故一般而言δCH > δCH2>δCH3[6]。

②共轭效应指苯环氢被含饱和杂原子基团取代(如OCH3、OH)，杂原子未成键电子对和苯环离域电子形成p-π共轭，苯环电子云密度增大，化学位移高场位移；被含不饱和杂原子基团取代(如CHO、COR、NH=NR)，形成大的π-π共轭，苯环电子云密度下降，化学位移低场位移。

Stapfianine B氢谱可见一个1,2,4-三取代苯环和一个1,2-二取代苯环信号，七个氢均位于芳环化学位移范围内(δH6.5～8.0)。苯的化学位移为δH7.27，受取代基影响取代苯环的氢产生低场或高场位移。Stapfianine B的B环中羰基-1′与苯环存在π-π共轭，导致苯环电子云密度降低，H-6′受影响最大，H-4′处在羰基对位，受到的去屏蔽作用次之，而H-5′和H-3′反而受到了一定屏蔽作用[7]。基于此，化学位移应该是H-6′ > H-4′ > H-5′/H-3′(图2A)。另一方面，OH-2′氧孤对电子与苯环形成p-π共轭，导致电子云密度上升，对邻位氢屏蔽作用最大，对位氢屏蔽其次，间位氢影响最小。因此化学位移应该是H-6′/H-4′ > H-3′ > H-5′(图2C)。综合羰基和羟基影响，B环结果是H-6′ > H-4′ > H-5′ > H-3′。A环分析稍复杂些，因还受到NH影响，其屏蔽作用与OH相比稍弱。如图1所示从羰基-1影响看，化学位移是H-6 > H-4 > H-3；从OH-5影响上看，化学位移为H-3 > H-4 > H-6；NH影响上看，化学位移是H-4 > H-6 > H-3。综合羰基、羟基和氨基影响，结果为H-3 > H-6 > H-4。以上分析与图谱吻合，这种讲解可加深学生对共轭效应的理解和记忆，教学效果良好。

图2 取代基对stapfianine B苯环电子云分布的影响(A：羰基；B：氨基；C：羟基)

③各向异性效应指分子中基团电子云非球形对称时，将对邻近质子附加一个各向异性磁场，使某些质子处于该基团屏蔽区，产生高场位移，某些质子处于去屏蔽区，产生低场位移。这里主要向学生介绍芳环、双键、羰基、叁键的屏蔽区和去屏蔽区位置。

④van der Waals效应指两个质子空间上靠近时，具有负电荷的电子云相互排斥，电子云密度减少，化学位移向低场位移，可举典型例子讲解。

⑤氢键效应指形成分子内氢键后，由于静电场作用电子云密度降低而去屏蔽，化学位移增大。天然产物中δH10～18羟基峰即为氢键效应导致。如stapfianine B中OH-2′(δH12.34 s)与酰胺键羰基形成氢键[8-9]。类似，NH也与甲酰基羰基形成氢键而产生低场效应(δH11.94 s)。

2.1.3 偶合裂分及耦合常数 耦合裂分是分子中邻近磁性核之间自旋-自旋耦合作用引起，作用大小以偶合常数表示。解析氢谱耦合裂分现象对于确定分子中各类氢的相对位置和立体关系很有帮助。可依据n+1规律判断：当某组质子有n个相邻的质子时，这组质子将裂分为n+1重峰。耦合常数是氢谱重要数据，影响偶合常数因素主要有偶合核间的距离、角度及电子云密度[10]。Stapfianine B中氧甲基、酚羟基及酰胺氨基邻位没有氢取代，故为单峰(s)。A环中H-3与H-4发生J3偶合，故峰形为标准二重峰(d)，苯环J3偶合常数一般约8.0 Hz(实际8.8 Hz)。H-6与H-4发生J4偶合，峰形也为d峰，J4偶合常数比较小，一般0～3 Hz(实际2.4 Hz)。H-4则除了与H-3发生J3偶合，还与H-6发生J4偶合，故峰形为双二重峰(dd)，偶合常数为8.8 Hz和2.4 Hz。B环是不同基团的邻位取代苯环，谱图非常复杂。但因核磁仪器频率不高，苯环氢化学位移差异小，可作一级谱近似分析。H-3′和H-6′邻位只有1个氢，故裂分为d峰，H-4′和H-5′邻位2个氢，故裂分为三重峰(t)。

2.213C-NMR和DEPT13C-NMR灵敏度低于氢谱但分辨率更高(常用δH0～15，δC0～300)，且碳原子是构成有机物骨架的元素，13C-NMR可提供分子骨架信息，故在有机物结构鉴定中作用极大。这里主要向学生介绍常用13C-NMR测定技术质子宽带去耦法和DEPT法进行结构解析(图3)。与氢谱类似碳谱横坐标是化学位移(δ)，纵坐标为吸收峰强度。采用去耦技术的碳谱只有谱线而不进行积分。13C-NMR谱中每一个碳都出现一个信号，而DEPT 135°谱季碳消失，亚甲基向下，次甲基和甲基向上，DEPT 90°谱只有向上的次甲基。据此可判断每个碳的级数，区分结构中的季碳、次甲基、亚甲基和甲基。

Stapfianine B中15个碳均在13C NMR谱出现信号。13C-NMR谱中酯基和酰胺基的羰基化学位移在最低场，分别在δC168.9 s和δC168.8 s。氧甲基(δC52.9 q)碳受到诱导效应而产生明显低场位移，一般RCH3约δC15～30，OCH3则δC45～60。苯的碳化学位移为δC128，与氢类似受取代基影响化学位移在δC120～160波动。同样对于选定的碳原子，其变化量是几个取代基效应之和。B环中C-2′因为电负性取代基的诱导效应影响(OH-2)，出现在δC162.2。羟基取代使苯环其它碳原子高场位移，影响大小邻位(C-1′/C-3′)>对位(C-5′)>间位(C-6′/C-4′)，故化学位移为C-2 > C-4/C-6 > C-5 > C-1/C-3。羰基取代对苯环取代碳和其它碳影响都较小，仅使苯环碳略往低场移动。结合羟基和羰基影响，B环化学位移为C-2 > C-4 > C-6 > C-5 > C-3 > C-1。A环和B环类似，但增加了氨基影响，其效应与-OH一致。

图3 Stapfianine B的13C-NMR谱

2.3 二维核磁共振谱 2D NMR是有机物结构鉴定的有力工具，尤其是对未知物的结构的推导，比1D NMR能够提供更多的信息，更为客观、可靠。常用的2D NMR技术主要有1H-1H COSY、HMQC、HMBC和ROESY等，结合stapfianine B的图谱向学生依次进行介绍。

2.3.11H-1H COSY谱1H-1H COSY是最常用的2D NMR谱，反映的同一个耦合体系中质子的相关(3J)，即相邻两个碳上的氢或同一个碳化学不等价的两个氢的相关。在谱图中可以看到stapfianine B的A环H-3/H-4的相关，B环H-3/H-4，H-4/H-5，H-5/H-6的相关(图4)。这些相关验证了1D NMR对Stapfianine B结构的推断。

2.3.2 HSQC谱 HSQC谱反映的是1H和与其直接相连13C的相关。通过HSQC可建立碳谱和氢谱的关联，实现氢原子往碳原子上的归属，对于推导未知物的结构或已知结构化合物的碳谱和氢谱的指认十分重要。在谱图中可以看到A环H-3/C-3，H-4/C-4、H-6/C-6的相关(图5)；B环H-3/C-3，H-4/C-4，H-5/C-5，H-6/C-6的相关，通过这些相关可对stapfianine B的碳氢谱数据进行归属。氢谱中剩余无相关的峰组，则认为是活泼氢(OH，NH)。

图4 Stapfianine B的1H-1H COSY谱(表示1H-1H COSY相关)

图5 Stapfianine B的HSQC谱

2.3.3 HMBC谱 HMBC谱反映的是1H和远程耦合的13C的相关，即关联跨越2～4根化学键的1H和13C。HMBC谱比较复杂，解析困难，但对于推断结构极为重要。因为1H-1H COSY谱和HMQC谱在未知物的结构推断中，往往终止于季碳和杂原子，只能得到结构片段，这些片段的连接只能依靠HMBC谱来完成。Stapfianine B的关键HMBC相关如图6所示，H-3/C-2，属于相隔2根化学键的相关，H-3/C-1，H-3/C-5是相隔3根化学键的相关，在HMBC谱中作用最大。H-6′与酰胺键羰基的相关正是Stapfianine B中两个片段通过酰胺键连接的关键证据。H-6与甲酰基羰基相关是甲酰基-1取代位置的关键证据。从这个图谱可以让学生清楚了解HMBC谱图在结构解析中的强大功能。

图6 Stapfianine B的HMBC谱(表示HMBC相关)

2.3.4 ROESY谱 ROESY谱反映的是两个氢的空间距离，主要用于解决立体化学的问题。谱中H-3/H-4，H-3′/H-4′，H-4′/H-5′，H-5′/H-6′的相关属于邻位氢相关，在结构鉴定中意义不大(图7)。H-6′/氨基的相关对于验证和确定B苯环的取代基位置有一定参考意义。

图7 Stapfianine B的ROESY谱(表示ROESY相关)

3 教学效果

天然药物化学的结构解析内容抽象难懂，学生难以理解和掌握。教材着重于基础理论而应用性不强，学生往往掌握了课本知识遇到具体天然产物的NMR解析仍无从下手。通过科研中的原始天然产物真实谱图的清晰展示和详细讲解，系统地向学生介绍核磁共振主要谱图的功能。学生可以直观、具体地接触到核磁谱图，从而更好地理解与掌握NMR的相关知识及其应用。讲解过程，学生可充分参与进来，通过辨识谱峰(包括溶剂峰、杂质峰)，获得化学位移和积分数据，计算偶合常数，寻找二维相关等，使知识不再停留在理论，学生可获得综合运用波谱进行化合物结构解析的能力，掌握天然化合物结构解析的方法和步骤。这种教学方式有助于学生接受与理解教学内容，让学生深刻理解该课程的意义，并通过对课程的学习养成良好的科研素养，也提高了课程的实践性，提高学生学习新知识的主动性和积极性，为培养创新型、实践型高素质人才打下坚实基础。

[1]李捷, 张蒙, 缪珊, 等.天然药物化学合并波谱解析教学的新思路[J]. 卫生职业教育, 2014, 32 (9): 44-45.

[2]邹宏斌, 莫建霞, 朱卡林, 等. 药物波谱解析课程的优化与融合探索[J]. 药学教育, 2015(5):32-35.

[3]蔡乐, 曹秋娥, 韦琨, 等. 通过retusiusine A的核磁共振解析讲授研究生课程《物质结构鉴定与表征》[J]. 中国当代医药, 2017, 24 (3): 143-148.

[4]Yin TP, Cai L, Li Y, et al. New alkaloids from Aconitum stapfianum [J]. Nat Prod Bioprospect, 2015, 5 (6): 271-275.

[5]Yin TP, Cai L, Fang HX, et al. Diterpenoid alkaloids from Aconitum vilmorinianum [J]. Phytochem, 2015(116): 314-319.

[6] 尹田鹏, 蔡乐, 雷刚, 等. 宾川乌头根中两个新的二萜生物碱[J]. 有机化学, 2013, 33 (12): 2528-2852.

[7] He JM, Yin TP, Chen Y, et al. Phenolic compounds and antioxidant activities of edible flowers of Pyrus pashia [J]. J Funct Foods, 2015(17): 371-379.

[8] Diaz JG, Marapara JL, Valdes F, et al. Dianthramide glucosides from tissue cell cultures of Delphinium staphisagria L [J]. Phytochem, 2005, 66 (6): 733-739.

[9] Lee TH, Chen YC, Lee CK, et al. Aconitamide, a novel alkaloid from the roots of Aconitum carmichaeli [J]. Nat Prod Commun, 2013, 8 (6): 827-828.

[10]Oguadinma P, Bilodeau F, LaPlante SR. NMR strategies to support medicinal chemistry workflows for primary structure determination [J]. Bioorg Med Chem Lett, 2017, 27 (2): 242-247.