正交试验优化黑轮层炭壳菌抗氧化活性成分提取工艺研究*

莫贵友，伍娇琪，任青媛，贺新生，黄 毅

（西南科技大学生命科学与工程学院，四川 绵阳 621010）

黑轮层炭壳菌（Daldinia concentrica） 为炭角菌科（Xylariaceae） 炭轮菌属 （Daldinia） 的1种高等真菌，在美洲、欧洲和亚洲等地区均有发现[1]。其主要生活于死亡和腐烂的木头表面，危害树木及建筑用木材，特别是生在栽培木耳、香菇、灵芝等经济真菌的椴木上，因而常被视为杂菌[2]。然而近年来，对该菌药理活性和化学成分的研究发现，其具有广泛的药理学功效，其挥发油具有抗植物病原真菌作用[3]，香豆素和固醇类成分具有抗癌和抗细菌作用[4]，特别是苯丙呋喃内酯类化合物Concentricolide还具有抗艾滋病病毒的作用[5]。这些研究均说明该杂菌可能具有一定的开发价值。

大量研究试验发现，过多的活性氧会损害机体，导致细胞DNA损伤，并可诱发心脏病、癌症和衰老等[6]。而抗氧化剂是一类能够保护机体免受因自由基产生的氧化损伤的重要物质。因此，抗氧化剂特别是天然抗氧化剂的发现近年来获得科学和工业界愈来愈多的关注[7]。课题组在对天然大型真菌抗氧化剂的初步筛选系列工作中发现黑轮层炭壳菌有较强的抗氧化活性，由于氧化压力与诸多疾病的成因有关，为了该菌生物活性评价的开发以及抗氧化活性物质后续分离工作的开展，本试验采用正交试验对黑轮层炭壳菌抗氧化活性成分的提取工艺进行优化，为后续分离工作的开展和该菌的应用开发提供一定的理论基础。

1　材料与方法

1.1　供试菌株

黑轮层炭壳菌子实体，见图1。于2016年采自四川省绵阳市北川县，经本文作者之一，菌物学教授贺新生鉴定为炭角菌科，炭轮菌属的黑轮层炭壳菌，拉丁名Daldinia concentrica(Bolton)Ces.&De Not.,Comm.Soc.crittog.Ital.1(4):197(1863)。现菌种凭证标本保存于西南科技大学微生物实验室。真菌子实体用纯水清除外部杂质，室外风干后于50℃烘干至恒重。干燥的子实体粉碎过50目筛，避光干燥保存备用。整个提取工艺优化试验在1个月内完成。

图1　树干上的野生子囊果和子囊果横切面Fig.1　Wild ascocarp on the trunk and cross-section of the ascocarp

1.2　试剂

DPPH（1，1-二苯-2-苦肼自由基） 购自梯希爱（上海）化成工业发展有限公司，无水乙醇购自成都市科龙化工试剂厂，以上试剂均为分析纯。纯水为实验室自制（电阻率为18 MΩ·cm）。

1.3　设备

可见光分光光度计，7200型，龙尼柯（上海）仪器有限公司；小型中药材粉碎机，上海淀久中药机械厂；涡旋混合器，XH-C型，金坛市天竟实验仪器厂；小型离心机，D1008E型，美国Scilogex有限公司；数控超声波清洗器，KQ-200KDE型，昆山市超声仪器有限公司；电子天平，BSA124S型，德国赛多利斯有限公司。

1.4　试验方法

1.4.1样品提取

本试验采用超声辅助提取方法（超声功率恒定为200W），基本方案为准确称取500 mg的黑轮层炭壳菌粉末于具塞锥形瓶中，加入10 mL无水乙醇，封口并记录瓶重，超声提取10min后，按记录重量补充原溶剂后，将提取液于10000 r·min-1离心1 min，取上清液用于DPPH抗氧化活性检测，每个样品平行制样3组。

1.4.2DPPH抗氧化活性检测

提取物抗氧化活性通过DPPH自由基清除率进行判定，采用文献 [8]的方法略作修改。准确移取200μL样品溶液与4 mL DPPH溶液（30 mg·mL-1，由无水乙醇配制，该溶液517 nm处吸光度值在0.8附近）置于试管中，涡旋混匀后避光5min，10000 r·min-1离心1 min，取上清转入比色皿，室温下测定517 nm处吸收值。该值伴随自由基清除剂量的增多而减弱[9]，样品抗氧化能力可用清除率（scavenging rate，简写为SR，%）来表示，计算公式如下：

式中：Ai为0.2 mL测试溶液与4 mL DPPH溶液混合后的吸光度值；Aj为0.2 mL测试溶液与4 mL无水乙醇溶剂混合后的吸光度值；A0：0.2 mL制备测试溶液时所用溶剂与4 mLDPPH溶液混合后的吸光度值。

1.4.3单因素试验

影响提取效果的因素主要包括乙醇浓度、浸提温度、提取时间和固液比，通过初步考察发现浸提温度对提取物抗氧化活性影响不大，因此选取剩余3因素进行单因素试验。在固定其他因素水平情况下，分别考察了提取液醇水比（即乙醇浓度，100%、60%、50%、40%和0），浸提时间（5min、30 min、60 min、90 min和120 min） 和固液比3:100（即30 mg·mL-1）、9:100（即90 mg·mL-1）、3:20（即150 mg·mL-1）和3:10（即300mg·mL-1）。为保证固液比测定的准确性，不同固液比提取的最终溶液均稀释到相同浓度进行抗氧化活性测试比较。以上所有试验均同时制备3组。

1.4.4正交试验

在单因素试验结果基础上，在各因素试验的自由基清除率极大值附近选取4个水平，以DPPH自由基清除率为指标，设计三因素四水平正交水平表L16（43）进行正交试验（见表1），优化黑轮层炭壳菌中抗氧化活性成分的提取工艺。

表1 L16（43）正交试验因素与水平设计Tab.1　Factors and levels in the L16(43)orthogonal test

2　试验结果

2.1　单因素试验

2.1.1乙醇浓度对抗氧化活性的影响

溶剂中乙醇浓度对抗氧化活性的影响情况，见图2。

图2　溶剂中乙醇浓度对抗氧化活性的影响Fig.2　Effectof ethanol concentrations on the antioxidative activity

从图2可以看出，无水乙醇和纯水均不能最大化提取黑轮层炭壳菌中的抗氧化活性物质，伴随着乙醇浓度的升高，DPPH自由基清除率逐步增大，在60%时该值基本达到最大值，所获提取液抗氧化活性最强。

2.1.2提取时间对抗氧化活性的影响

提取时间对抗氧化活性的影响情况见图3。

图3　提取时间对抗氧化活性的影响Fig.3　Effectof extraction time on the antioxidative activity

从图3可以看出，伴随着提取时间的延长（5 min～90 min），DPPH清除率逐渐增大，90 min后DPPH清除率随时间的延长增大不明显且有所减少。该结果说明提取时间对抗氧化活性成分的浸出有较大帮助，但过长的时间并不能带来提取效果的继续增加且对工业生产成本不利。

2.1.3固液比对抗氧化活性的影响

固液比对抗氧化活性物质提取的影响情况，见图4。

图4　固液比对抗氧化活性物质提取的影响Fig.4　Effectof solid-liquid ratio on the antioxidative activity

从图4可以看出，固液比在3:100（30mg·mL-1）～9:100（90 mg·mL-1）时，DPPH自由基的清除率随着固液比的增大逐渐增大。当固液比超过9:100（90 mg·mL-1）时，清除率反而随之下降，说明固液比过分增大时，不易从黑轮层炭壳菌中提取抗氧化活性成分。结合图4显示固液比在9:100（90 mg·mL-1）时，DPPH自由基清除率最大。

2.2　正交试验

正交试验结果和分析见表2和表3。

极差R值分析表明，3种因素的主次关系是RB>RC>RA，即乙醇浓度（B） ＞固液比（C） ＞提取时间（A）。因此最佳组合为A1B1C1，即浸泡超声提取时间30 min，乙醇浓度100%，固液比为3:100（即30 mg·mL-1）。按照正交试验所确定的最佳提取条件进行验证性试验，计算得到黑轮层炭壳菌抗氧化活性物质DPPH自由基清除率为76.87%，对比自由基清除率最大值为60.38%，证明正交试验结果对黑轮层炭壳菌抗氧化活性成分提取的优化作用明显。

表2　正交试验结果Tab.2　Results of the orthogonal test

表3　正交试验结果分析Tab.3　Data analysis of the orthogonal test

3　结论

全球范围内真菌资源丰富[10]，是活性天然产物开发的巨大源泉。由于抗氧化活性和很多疾病治疗的联动效应，真菌资源中的抗氧化活性化合物的发现更应该成为科学和工业界关注的热点。

在真菌中，常见的抗氧化活性成分主要有多酚类、三联苯类、聚酮类、生物碱、萜类、甾体和多糖类[11]。目前，黑轮层炭壳菌中已发现的化学成分包括倍半萜烯、角鲨烯型三萜类化合物和麦角甾醇等[12-15]，但并没有关于这些化学成分的抗氧化活性报道。唯一报道具有自由基清除作用的是Lee于2015年从该菌中分离出来的异吲哚啉酮衍生物 Daldinan A[16]。因此，该菌中抗氧化活性成分的物质基础是哪个或哪类化合物实际还并不清晰。

本文通过单因素试验和L16（43）正交试验，得到了从黑轮层炭壳菌中获得抗氧化活性成分的最佳提取条件：提取时间30min，乙醇浓度100%，固液比3:100（即30 mg·mL-1）。其中乙醇浓度对抗氧化活性物质的提取影响最大。以上的试验结果，为该菌抗氧化活性成分未来分离工艺摸索和该菌作为食（药）用保健品的开发打下良好基础。

参考文献：

[1]Singh J.Buildingmycology:management of decay and health in buildings[M].London:Taylor and Francis,1994.

[2]贺新生.四川盆地蕈菌图志[M].北京：科学出版社，2011：12-13.

[3]罗都强，唐宏亮，杨小龙，等.从子囊菌炭球菌中分离的活性成分L-696,474和Cytochalasin D对植物病原真菌的活性[J].植物保护学报，2007，32（2）：113-122.

[4]Liarzi O,Bar E,Lewinsohn E,et al.Use of the endophytic fungusDaldinia cf.concentricaand its volatiles as bio-control agents[J].Plos One,2016,11(12):0168242.

[5]Qin XD,Dong ZJ,Liu JK,et al.Concentricolide,an anti-HIV agent from the ascomyceteDaldinia concentrica[J].Helvetica Chimica Acta,2006,89(1):127-133.

[6]樊岫珊.羟基自由基诱导DNA损伤机理研究进展[J].生物学杂志，2017，195（1）：80-84.

[7]Mukthapura A,Shimogga A,Vinodchandran K,et al.Oxidative products of proteins and antioxidant potential of thiols in gastric carcinoma patients[J].Journal of Medical Biochemistry,2010,29(2):102-106.

[8]Pyrzynska K,PekalA.Application of free radicaldiphenylpicrylhydrazyl(DPPH)to estimate the antioxidant capacity of food samples[J].AnalyticalMethods,2013,5(17):4288-4295.

[9]李铉军，崔胜云.抗坏血酸清除DPPH自由基的作用机理[J].食品科学，2011，398（1）：86-90.

[10]Boa E.Ainsworth and bisby’s dictionary of the fungi[J].Plant Pathology,2002,47(4):541.

[11]李峻志，吴小杰，党永，等.大型真菌抗氧化活性物质的研究进展[J].食品与生物技术学报，2014，170（5）：455-465.

[12]常丽影，周贤，李爱欣，等.药用真菌炭球菌生药学研究[J].亚太传统医药，2014，117（17）：21-23.

[13]Qin XD,Shao HJ,Dong ZJ,et al.Six new induced sesquiterpenes from the cultures of ascomyceteDaldinia concentrica[J].Journal of Antibiotics,2008,61(9):556-562.

[14]Stadler M,Baumgartner M,Grothe T,et al.Concentricol,a taxonomically significant triterpenoid fromDaldinia concentrica[J].Phytochemistry,2001,56(8):787-793.

[15]Ngoc QD,Toshihiro H,Masami T,et al.Concentriols B,C and D,three squalene-type triterpenoids from the ascomyceteDaldinia concentrica[J].Phytochemistry,2002,61(3):345-353.

[16]Lee IK,Kim SE,Yeom JH,et al.Daldinan A,a novel isoindolinone antioxidant from the ascomyceteDaldinia concentrica[J].Journal of Antibiotics,2012,65(2):95-97.