超声波处理对磷脂酶脱除菜籽油中磷脂的影响

任晓锋，徐保国，齐文慧，梁秋芳，张熙，马海乐，刘尧刚，王志荣

（1.江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江212013；2.金太阳粮油股份有限公司，江苏南通226403）

油菜籽经压榨或者浸出所得到的油称为毛油，通常不能直接食用，需要经过一系列的油脂精炼工序（脱胶、脱酸、脱色和脱臭，简称“四脱”），使毛油的各项指标达到国家标准后，才能供人们食用[1]。其中，脱胶是油脂精炼的第一个工序，其主要目的是脱除菜籽毛油中的磷脂，若磷脂没有脱除到合适的范围内，对油脂后续脱酸、脱色和脱臭的精炼过程造成非常不利的影响，不仅导致精炼的时间延长和难度加大，而且严重降低精炼油的品质。酶法脱胶是将磷脂酶用于油脂脱胶的过程中，不仅脱胶效果好，而且脱胶过程中性油损失少，油脂得率高，是一种绿色环保、适用范围广且能为企业创造高经济效益的脱胶方法。然而，酶法脱胶的反应时间较长，酶消耗量大，增加了酶法脱胶的生产成本，限制了该方法在油脂脱胶工业中的应用[2-3]。

磷脂酶催化水解磷脂的反应一般是在油水界面处进行的，酶催化效率受到油水界面面积的影响；此外，酶反应效率还取决于传质效率和酶分子的构象[4]。超声波作为一种机械波，广泛应用于食品加工中的各个单元操作中，较低强度的超声处理可导致酶分子能量的增加和介质温度的升高，引起酶分子构象的微小变化，使酶分子的超微结构更合理，从而表现出较高的催化活性。此外，超声波空化效应产生的空化气泡，在不互溶的两相边界破裂时，增加了酶催化反应的界面面积；并且空化气泡破裂形成的微射流对溶液产生了很强的搅拌和剪切作用，也增加了酶的传质效率[5-6]。因此，从理论上分析，超声波作用不仅可以提高酶法脱胶的效率，缩短脱胶的时间，而且可以提高脱胶的效果。然而，截至目前，关于多频超声波处理技术在酶法脱胶过程中的应用尚未报道。因此，本研究在优化菜籽油酶法脱胶的基础上，将多频超声波与菜籽油酶法脱胶相结合，研究超声处理对菜籽油酶法脱胶的作用效果，以期为多频超声酶法脱胶的工业化应用提供理论依据。

1　材料和方法

1.1　材料

磷脂酶A1（酶活10 KLU/g)：杰能科（中国）酶制剂有限公司；菜籽油毛油：江苏金太阳粮油股份有限公司，未经过水化预脱胶，初始含磷量为（467.32±4.79）mg/kg；柠檬酸、氢氧化钾、盐酸、氧化锌、硫酸钠、钼酸钠、硫酸联氨、磷酸二氢钾等试剂均为分析纯：国药集团上海化学试剂公司。

1.2　仪器及设备

多模式超声波发生装置：江苏大学研制；WFJ 7200型可见分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司；PHS-3C精密pH计：上海精密科学仪器有限公司；LD5-2A离心机：北京医用离心机厂；1010-3B型电热鼓风干燥箱：上海实验仪器厂有限公司；SHZ-88A往复式水浴恒温振荡器：太仓市实验设备厂；SX2-4-10-S马弗炉：上海帅登仪器有限公司。

1.3　试验方法

1.3.1　酶法脱除菜籽油中磷脂的方法及工艺优化

准确称取菜籽毛油100 g于250 mL的具塞锥形瓶中，放进恒温水浴锅中加热到80℃；滴加0.13 mL质量浓度为40%的柠檬酸溶液；然后在转速为10 000 r/min的均质机内均质1 min，均质结束后在80℃的温度下搅拌30 min，搅拌的转速为500 r/min；加入4 mol/L的NaOH溶液和一定量的去离子水混合均匀。调节pH值并滴加一定量的水，再搅拌后加入磷脂酶A1在一定的酶解条件下进行酶解，最后将酶解后的菜籽油升温至90℃，灭酶10 min；在8 000 r/min的转速下离心10 min，收集上层油层；旋转蒸发浓缩得到脱胶菜籽油，测定其中磷脂的含量。按照上述步骤优化酶解时间、磷脂酶用量、菜籽油含水量、反应pH值和反应温度等酶法脱除菜籽油中磷脂的工艺。

1.3.2　多模式超声波辅助酶法脱除菜籽油中磷脂的方法

准确称取菜籽毛油100 g于250 mL的具塞锥形瓶中，放进恒温水浴锅中加热到80℃；滴加0.13 mL质量浓度为40%的柠檬酸溶液；然后在转速为10 000 r/min的均质机内均质1 min，均质结束后在80℃的温度下搅拌30 min，搅拌的转速为500 r/min；加入4 mol/L的NaOH溶液和一定量的去离子水混合均匀。调节pH值并滴加一定量的水，再搅拌后加入磷脂酶A1，在最优的酶解条件下进行酶解同时进行超声处理。超声的条件：20、50、20/50、20/35/50 kHz的不同超声频率组合，超声功率为50 W～300 W，超声波脉冲工作方式为工作10 s、间隔3 s；在超声波反应器内搅拌（500 r/min）酶解反应一定时间，将酶解后的菜籽油升温至90℃，灭酶10 min；在8 000 r/min的转速下离心10 min，收集上层油层；旋转蒸发浓缩得到脱胶菜籽油，测定其中磷脂的含量。

1.3.3　菜籽油中磷脂含量的测定

按照GB/T 5537-2008《粮油检验磷脂含量的测定》测定。

2　结果与分析

2.1　磷脂酶脱除菜籽油中磷脂的工艺优化

2.1.1　酶解时间对磷脂酶脱除菜籽油中磷脂的影响

酶解时间对磷脂酶脱除菜籽油中磷脂的影响如图1所示。

图1　酶解时间对磷脂酶脱除菜籽油中磷脂的影响Fig.1　Effect of reaction time on phospholipase removal from rapeseed oil by phospholipase

从图1可以看出，酶解反应30 min后，菜籽油中的含磷量迅速下降。与对照相比（不加磷脂酶），酶法处理的菜籽油中磷脂含量降低速度明显比常规条件下的速度要快，加入磷脂酶A1酶解反应30 min后的菜籽油含磷量降低到35mg/kg左右，而不加入磷脂酶A1的菜籽油含磷量降低到60mg/kg左右。随着反应的继续进行，当反应到3 h以后，菜籽油的磷脂脱除的速率趋于平缓，继续增加反应时间菜籽油的含磷量变化不大，这与毛程鑫等的研究结果一致[7]。综合考虑将酶脱除磷脂的反应的时间定为3 h，这样既能够让酶解反应顺利进行，也可以提高后续试验中磷脂酶的脱除磷脂效率。

2.1.2　酶用量对磷脂酶脱除菜籽油中磷脂的影响

磷脂酶A1添加量对磷脂酶脱除菜籽油中磷脂的影响如图2所示。

图2　酶用量对磷脂酶脱除菜籽油中磷脂的影响Fig.2　Effect of enzyme dosage on phospholipase removal from rapeseed oil by phospholipase

从图2可以看出，磷脂酶A1的用量变化对菜籽油脱磷脂有很大影响。菜籽油含磷量随着酶用量的增加而降低，当酶用量在15 μL/kg时，菜籽油的含磷量为55mg/kg，与菜籽油毛油的含磷量相比，脱胶油的含磷量降低了90%。当酶用量在90 μL/kg时，菜籽油脱胶油的含磷量为22mg/kg；继续增大酶的用量，磷含量虽然有所降低，但整体变化不大；当酶用量为120 μL/kg时，菜籽油含磷量降低到21mg/kg。考虑到生产成本，最适酶添加量，可选90 μL/kg。

2.1.3　菜籽油毛油含水量对磷脂酶脱除菜籽油中磷脂的影响

菜籽油毛油含水量对磷脂酶脱除菜籽油中磷脂的影响如图3所示。

图3　含水量对磷脂酶脱除菜籽油中磷脂的影响Fig.3　Effect of water content on phospholipid in rapeseed oil by phospholipase

酶解后菜籽油含磷量随含水量的增加而降低。这说明含水量对磷脂酶脱除菜籽油中的磷脂起到了一定的作用，因为磷脂酶是水油界面酶，因此必须要有水的存在，磷脂酶才会发挥作用。与对照组相比，加入磷脂酶的脱胶效果优于不加入磷脂酶的脱胶效果，这说明磷脂酶在该反应中降低菜籽油脱胶油中磷脂的主要因素之一。从图3可以看出，随着含水量的增加，两组试验的含磷量都得到了降低，加入磷脂酶的菜籽油毛油在1%的含水量时的含磷量为37mg/kg；在2%的含水量时的含磷量为20.7mg/kg，达到了最低。由图中可以看出，当含水量为5%时，可能造成磷脂的乳化，反而会增加后期试验中分离的难度[8]。出于对磷脂酶A1的脱胶效果的考虑，较适菜籽油毛油的含水量为2%。

2.1.4　pH值对磷脂酶脱除菜籽油中磷脂的影响

菜籽油毛油pH值对磷脂酶脱除菜籽油中磷脂的影响如图4所示。

图4　pH值对磷脂酶脱除菜籽油中磷脂的影响Fig.4　Effect of pH on phospholipid removal from rapeseed oil by phospholipase

反应体系pH值变化，会引起菜籽油脱胶油含磷量的显著变化。磷脂酶A1是酸性酶，反应体系的pH值会影响磷脂酶A1的反应活性[9]。从图4中可以看出，随着pH值的增加，菜籽油脱胶油的含磷量先降低后上升。在pH值为4.8时降到最低，此时菜籽油脱胶油的含磷量为18mg/kg；在pH值上升到5.4时，菜籽油脱胶油的含磷量为38mg/kg。通过试验结果可以看出，磷脂酶A1脱除菜籽油中磷脂的较适pH值为4.8，此时菜籽油中磷脂的脱除效果最好，较适反应pH值为4.8。

2.1.5　反应温度对磷脂酶脱除菜籽油中磷脂的影响

反应温度对磷脂酶脱除菜籽油中磷脂的影响如图5所示。

图5　反应温度对磷脂酶脱除菜籽油中磷脂的影响Fig.5　Effect of reaction temperature on phospholipase removal from rapeseed oil by phospholipase

对照组的含磷量受反应温度变化的影响不大，含磷量在55 m/kg的数值上下波动。反应温度对磷脂酶脱除菜籽油的试验有影响，温度是影响酶活性的主要因素之一[7]，随着反应温度的升高，含磷量呈现先降低后升高的现象。结合酶的反应特性可以得出，当温度从20℃不断升高到40℃时，菜籽油的含磷量不断降低，从30mg/kg降到最低16mg/kg；温度不断升高，菜籽油的含磷量又不断上升，到60℃时，菜籽油的含磷量为45mg/kg，再升高温度，酶容易失活，脱胶效果也较差。温度过低或者过高都会影响酶的活性，因此较适反应温度选择40℃。

2.2　多模式超声波辅助磷脂酶脱除菜籽油中磷脂的工艺优化

2.2.1　超声频率对磷脂酶脱除菜籽油中磷脂的影响

分别在 20、50、20/50、20/35/50 kHz的不同超声频率组合下对菜籽油进行超声辅助脱胶处理，多模式组合超声波频率对磷脂酶脱除菜籽油中磷脂的影响如图6所示。

图6　超声频率对磷脂酶脱除菜籽油中磷脂的影响Fig.6　Effect of ultrasonic frequency on phospholipase removal from rapeseed oil by phospholipase

由图6可见超声频率对磷脂酶脱除菜籽油中磷脂的影响较大，不同超声频率及组合作用下菜籽油脱胶油的含磷量也不同。当超声频率为20 kHz时，菜籽油脱胶油的含磷量为23mg/kg；当超声频率为50 kHz时，菜籽油脱胶油的含磷量为19mg/kg；当超声频率为20/50 kHz时，菜籽油脱胶油的含磷量为15mg/kg；当超声频率为20/35/50 kHz时，菜籽油脱胶油的含磷量为17mg/kg。超声频率为20/50 kHz时菜籽油毛油的磷含量最低，菜籽油的脱胶效果也最好，因此最适超声波频率组合为20/50 kHz。冯若等研究表明对反应体系作用以频率为fa的超声波时，只有体系的共振频率fr接近于fa时，体系的超声化学产额才能达到最大[10]。超声频率为20/50 kHz双频频率组合可能更加接近磷脂酶催化菜籽油反应体系的共振频率，所以菜籽油的脱胶效果最好。

2.2.2　超声功率对磷脂酶脱除菜籽油中磷脂的影响

超声功率对磷脂酶脱除菜籽油中磷脂的影响如图7所示。

图7　超声功率对磷脂酶脱除菜籽油中磷脂的影响Fig.7　Effect of ultrasonic power on phospholipase removal from rapeseed oil

超声波的功率强度对酶活性有较重要的影响，适当强度的超声波可以使酶活力达到最佳状态。相反，不适当强度的超声波处理不但不会增强酶活力，甚至可以降低酶的活力[11]。由图7可见在不同超声功率的作用下，磷脂酶脱除菜籽油中磷脂的试验效果明显，当超声功率为60 W时，菜籽油脱胶油的含磷量为14.2mg/kg；超声功率为120 W时，菜籽油脱胶油的含磷量为16.4mg/kg；超声功率为180 W时，菜籽油脱胶油的含磷量为10.13mg/kg；超声功率为240 W时，菜籽油脱胶油的含磷量为20.6mg/kg；超声功率为300 W时，菜籽油脱胶油的含磷量为16.5mg/kg。相比较得知，在超声功率为180 W时，超声辅助磷脂酶脱胶效果最为显著，接近标准规定的10mg/kg，因此，较适超声功率为180 W。朱少娟[12]等发现超声波影响酶及底物分子构象，适宜的超声波改变了酶与底物的荧光吸收光谱和荧光强度，可能使酶的活性中心更暴露，底物结构更松散，促进酶与底物的结合，适宜的超声波提高了胰蛋白酶的探讨水解效率。

2.2.3　超声时间对磷脂酶脱除菜籽油中磷脂的影响

超声时间对磷脂酶脱除菜籽油中磷脂的影响如图8所示。

图8　超声时间对磷脂酶脱除菜籽油中磷脂的影响Fig.8　Effect of ultrasonic time on phospholipid removal from rapeseed oil by phospholipase

由图8可见随着超声时间的增加菜籽油的含磷量也不断的下降。在超声开始的10 min内含磷量下降迅速，达到13.65mg/kg，对照组即仅采用磷脂酶A1处理的含磷量也下降到42.48mg/kg，超声处理能将菜籽油的含磷量明显降低。当超声时间超过30 min后，菜籽油的含磷量降到10mg/kg以下；超声60 min时菜籽油的含磷量下降到4.36mg/kg，与菜籽油毛油相比较，含磷量降低了99%，60 min以后基本稳定。根据对照组即仅采用磷脂酶A1处理，可以看出，虽然不超声处理只经过加酶处理也可以使菜籽油的含磷量降低，含磷量在37mg/kg上下波动，但是不能达到国家规定标准10mg/kg以下的要求，试验反应需要更长的时间。超声处理不仅可以降低菜籽油毛油的磷含量，而且还可以有效的缩短反应时间，大大的降低了工厂操作的时间，节约了反应成本以及人力[13]。因此较适超声处理时间为60 min。

3　结论

1）单因素优化磷脂酶脱除菜籽油中磷脂的工艺为：磷脂酶A1用量为90 μL/kg毛油，pH值为4.8，酶解反应温度为40℃，含水量为2%，酶解时间3 h；在此条件下，菜籽油的含磷量为16mg/kg。

2）适宜的超声波处理可显著提高磷脂酶A1对菜籽油的磷脂脱除率；超声波对磷脂酶A1的作用效果与超声功率、超声时间和超声频率密切相关；经过超声功率为180 W，超声频率为20/50 kHz，超声时间为60 min的多模式超声波辅助磷脂酶解，菜籽油磷脂含量降低至4.36mg/kg。

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