不同电刺激处理时间对宰后马肉成熟过程中嫩度的影响

孔令明，李 芳，张 文，达迪拉·买买提，杨海燕,*

马肉具有很高的营养价值，其瘦肉多、脂肪含量少，且脂肪中多不饱和脂肪酸含量高达61.0%～65.5%，胆固醇含量远低于牛、羊、猪肉。马肉的蛋白质含量也较高，一般为20.0%～24.0%，比猪肉和羊肉高，且含有20多种氨基酸，其中以赖氨酸最为丰富。马肉中还含有许多人体所需的维生素和矿物质，其中铁含量是猪肉的5～6 倍，牛、羊肉的8～9 倍，可以作为优质的补血食品[1]。近年来，人们越来越青睐于营养价值高的马肉，在日本、法国、德国、意大利等很多国家，马肉己成为深受欢迎的肉食品之一，故马肉在国际市场的需求量猛涨。我国有着丰富而优质的马肉资源，新疆是我国马匹的主要产区，熏马肠、熏马肉等传统马肉制品是新疆各族人民非常喜爱的具有民族特色的肉食品。

嫩度是肉的主要食用品质之一，也是消费者在评判肉品质好坏时最常用的评价指标之一。马肉存在肉质较为粗糙、嫩度较差的问题，这与马的品种、性别、年龄、饲养方式、宰后肉成熟时间、温度、结缔组织、肌原纤维和肌浆的含量及化学结构状态等多种因素有关。因此，为提高马肉的食用品质，适应现代消费者对肉品质鲜嫩、口感良好、嫩度适口的需求，采取有效的嫩化方法来改善马肉嫩度已成为必然。

目前，国内外关于改善马肉嫩度方面的研究报道很少。国内主要是针对马肉嫩度的测定、贮藏温度对马肉嫩度的影响以及采用蛋白酶处理对马肉进行嫩化等方面进行报道。巴吐尔·阿不力克木等[2]研究了不同贮藏温度对马肉不同部位嫩度变化的影响，结果表明，在15、4、-18 ℃下马肉的臀肌、肩肌和背最长肌的剪切力与蒸煮损失率呈负相关，与脂肪含量、系水力呈正相关；秦菊等[3]对伊犁地区马肉嫩度进行了测定和分析；蒋小锋等[4]对蛋白酶结合滚揉处理对马肉嫩度的影响进行了研究。国外主要为马肉保鲜过程中微生物组分及品质变化方面的研究报道[5-6]，有关电刺激处理促进马肉嫩度方面的理论研究尚鲜见报道。

国内外已有研究表明，对牛、羊胴体进行电刺激处理可以改善肉的嫩度：Hwang等[7]研究发现，电刺激处理可以加快牛肉糖酵解速度，降低pH值，防止冷收缩，使肌纤维结构断裂，加快肌肉组织的溶解，进而提高肉的嫩度；Toohey等[8]研究发现电刺激处理提高了羊肉的肌原纤维小片化指数（myofibrillar fraglllentation index，MFI），降低了剪切力，改善了肉的嫩度；Ferguson等[9]指出电刺激处理可以缩短牛肉成熟的时间，加快肉嫩化的过程；Pophiwa等[10]研究发现电刺激处理提高了山羊肉的嫩度；罗欣等[11]研究发现对宰后牛胴体进行电刺激处理可有效改善肉的嫩度；张睿等[12]研究发现电刺激处理明显降低了成熟过程中热剔骨牦牛西冷的剪切力，改善了肉的嫩度；郎玉苗等[13]研究发现电刺激处理与成熟结合可显著提高冷热剔骨牦牛肉的嫩度。

本研究以新疆马肉为原料，采用电刺激处理马肉，研究了不同电刺激处理时间在成熟过程中对马肉嫩度的影响，为马肉资源的品质改善、开发利用及产业化发展提供可靠的理论依据和技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

马肉：随机选取来自新疆伊犁州昭苏县草原牧马场自然放牧饲养、健康无病的伊犁公马18 匹（36～60 月龄，体质量（300±50） kg）。

异丙醇、对二氨基苯甲醛、高氯酸、碘乙酸、盐酸、乙醇、叔丁醇等均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

STIM E512电刺激仪 德国FREUND公司；TDL-5-A型离心机 上海安亭科学仪器厂；电热恒温水浴锅北京市永光明医疗仪器有限公司；数显温度计 美国Delta TRAK公司；DHG-9140A电热鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司；Tu-1810型紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；TA.XT2i型物性仪 英国Stable Micro Systems公司；SU8010扫描电子显微镜 日本Hitachi公司；FSH-2型可调高速匀浆机金坛市城东新瑞仪器厂；DZ-260P台式真空包装机上海青葩食品包装机械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 实验分组

电刺激处理组：马匹随机分成6 组，每组3 匹，选取其中一组作为对照组按正常流程屠宰，其余5 组正常宰杀放血后用电刺激仪进行电刺激处理（电压42 V、频率50 Hz、电流0.7 A），各组电刺激处理时间分别为20、40、60、80、100 s，待6 组马匹分割后取背最长肌，真空包装后置于0～4 ℃环境下成熟，分别在成熟1、3、7、14 d时取样，测定蒸煮损失率、剪切力、可溶性蛋白浓度（soluble protein concentration，SPC）、MFI、胶原蛋白溶解性，并且在扫描电子显微镜下观察肌原纤维的超显微结构。

1.3.2 蒸煮损失率的测定

称取马肉100 g，剔除可见结缔组织和脂肪，切分成小块，用蒸煮袋包装后，于80 ℃水浴中恒温加热至马肉的中心温度达到70 ℃，取出肉样冷却至常温，用滤纸拭干表面水分后称其质量。按下式计算蒸煮损失率。

1.3.3 剪切力的测定

将解冻好的肉样用滤纸拭干表面水分，沿着肌纤维方向切取1 cm×1 cm×5 cm的肉条，用TA.XT2i型物性仪测定其剪切力，每个处理组分别测定3 个肉样，取其平均值。剪切力测定参数为：探头HDP/BSW；测试模式TPA；测试前速率2.00 mm/s；测试速率2.00 mm/s；测试后速率10.00 mm/s；下压距离30.00 mm；负载类型Auto-20 g；数据获得率500 pps。

1.3.4 SPC和MFI的测定

SPC采用双缩脲法测定，牛血清白蛋白作为标准蛋白。MFI的测定按照Culler等[14]的方法。取4 g马肉，加入40 mL 4 ℃的MFI缓冲液（100 mmol/L KCl、11.2 mmol/L K2HPO4、8.8 mmol/L KH2PO4、1 mmol/L乙二醇二乙醚二胺四乙酸、1 mmol/L MgCl2、1 mmol/L NaN3），匀浆后，于离心机中10 000 r/min离心2 min，倒出上清液，用于测定SPC。沉淀继续在40 mL MFI缓冲溶液中搅拌成悬液，于10 000 r/min离心2 min，倒出上清液，沉淀在10 mL MFI缓冲溶液中制成悬液，用铜制筛网（40 目）过滤。然后用MFI缓冲液将滤液的蛋白质量浓度调整为0.5 mg/mL，于540 nm波长处测吸光度，将吸光度乘200即得到MFI。

1.3.5 胶原蛋白溶解性分析

采用Ringer’s试剂溶解法，参考Hill[15]和Bergman[16]等的方法，通过测定可溶性胶原蛋白含量与总胶原蛋白含量计算胶原蛋白的溶解性。

1.3.6 肌原纤维超微结构观察

样品制备参照Nishimura等[17]的方法并略作修改。将所制备好的肉样切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的肉块，于4 ℃下在戊二醛中固定72 h，然后用磷酸盐缓冲液分别清洗3 次，每次30 min，依次用体积分数50%、70%、80%、90%的乙醇溶液梯度脱水，各浸泡15 min，再用无水乙醇反复脱水3 次，每次30 min，脱水后用叔丁醇置换3 次，每次30 min。将置换后的样品切片，冷冻干燥，用离子溅射仪在样品表面镀一层金属膜，于扫描电子显微镜下观察肌原纤维的微观结构。

1.4 数据分析处理

用Minitab 16.0软件处理实验数据，用Tukey法进行显著性分析，用Excel 2003软件制作图形。以P＜0.05表示差异显著，以P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 不同电刺激处理时间对宰后马肉成熟过程中蒸煮损失率的影响

蒸煮损失率是评价肌肉保水性的重要指标之一。由图1可以看出，不同电刺激处理时间组马肉的蒸煮损失率差异不显著（P＞0.05），随着电刺激处理时间的延长，各处理组之间变化规律不明显，说明不同的电刺激处理时间均未对马肉的蒸煮损失率产生明显影响。郎玉苗等[13]研究发现，电刺激处理对牦牛背最长肌的蒸煮损失率没有显著影响，这与本实验的结果相一致。这可能是因为肌纤维膜需要较长时间才会失去保持水分的功能，因此电刺激处理对肌肉持水力没有明显影响[18]。而随着成熟时间的延长，不同处理组马肉的蒸煮损失率均呈现下降趋势。这可能是因为肉在成熟过程中尸僵渐渐消失，肌肉系水力回升使蒸煮损失率下降[11]。

图1 不同电刺激时间处理后马肉蒸煮损失率在成熟过程中的变化Fig. 1 Variation in cooking loss of horsemeat with different electrical stimulation durations during aging

2.2 不同电刺激处理时间对宰后马肉成熟过程中剪切力的影响

图2 不同电刺激时间处理后马肉剪切力在成熟过程中的变化Fig. 2 Variation in shear force of horsemeat with different electrical stimulation durations during aging

剪切力是评价肉嫩度最常用的指标之一。由图2可知，在电刺激0、20、40、60 s时，成熟1、3、7 d后，随着电刺激处理时间的延长，马肉的剪切力呈逐渐下降趋势，不同处理组之间马肉的剪切力差异显著（P＜0.05）。且同一电刺激时间处理后，随成熟时间的延长，马肉的剪切力呈明显下降趋势。当成熟时间为14 d时，不同电刺激时间处理组马肉的剪切力变化不明显。

电刺激60 s时，成熟1 d和14 d后马肉的剪切力分别较对照组下降了15.5%和13.8%，成熟14 d时马肉的剪切力较成熟1 d时下降了47.5%。国内外研究表明，电刺激处理加快了宰后肉的糖酵解速率及肌原纤维与骨架蛋白的降解速度，同时破坏了肌纤维结构，从而提高了嫩度[19-22]。但在电刺激60 s后，继续延长电刺激处理时间，马肉剪切力未继续呈现下降趋势，且电刺激处理100 s时，剪切力略有上升。适度的电刺激处理可以减小马肉成熟过程中的剪切力，但较长时间的电刺激处理可能导致肉发生热收缩[23]，从而使剪切力有增大的趋势。

2.3 不同电刺激处理时间对宰后马肉成熟过程中SPC的影响

图3 不同电刺激时间处理后马肉SPC在成熟过程中的变化Fig. 3 Variation in SPC of horsemeat with different electrical stimulation durations during aging

如图3所示，在电刺激处理0、20、40、60 s时，随着电刺激处理时间的延长，各处理组马肉的SPC呈上升趋势。电刺激处理20、40、60、80 s和100 s后，成熟14 d的马肉的SPC分别是对照组的1.05、1.07、1.16、1.17、1.17 倍。同时根据数据分析可知，电刺激处理时间为20、40 s处理组与对照组之间差异不显著（P＞0.05），而60、80、100 s处理组的马肉的SPC均显著高于前3 个处理组（P＜0.05），说明虽然不同电刺激处理时间均促进了马肉SPC的上升，但电刺激处理达到一定时间才会显著增强马肉的嫩化效果。在电刺激60 s后，随着电刺激处理时间的延长，马肉的SPC的变化趋于平缓。电刺激处理加快了糖酵解的反应速度，使pH值快速下降，钙激活酶的活性提高，肌原纤维蛋白及肌质网遭到破坏，肌细胞间钙离子的浓度升高，肌纤维降解速度加快，从而可能引起SPC的升高[24]。

2.4 不同电刺激处理时间对宰后马肉成熟过程中MFI的影响

图4 不同电刺激时间处理后马肉MFI在成熟过程中的变化Fig. 4 Variation in MFI of horsemeat with different electrical stimulation durations during aging

肌肉成熟过程中，肌原纤维从Z线断裂从而导致肌原纤维小片化，MFI是评价肉嫩度的一个非常重要的指标[25-27]，它反应了肌细胞内部肌原纤维及骨架蛋白的完整性。由图4可知，在电刺激0、20、40、60 s时，随着电刺激处理时间的延长，马肉的MFI呈上升趋势，差异显著（P＜0.05）。同时还可看出，随成熟时间的延长，各处理组及对照组马肉的MFI呈显著上升趋势，通过分析发现，不同成熟时间马肉的MFI存在极显著差异（P＜0.01）。电刺激60 s、成熟14 d时马肉的MFI是对照组的1.28 倍。由此可知，电刺激处理会使马肉成熟过程中的MFI显著上升。这可能是由于电刺激处理破坏了肌质网，加速了马肉肌原纤维蛋白的降解，从而引起MFI的升高[24]。

2.5 不同电刺激处理时间对宰后马肉成熟过程中胶原蛋白溶解性的影响

图5 不同电刺激时间处理后马肉胶原蛋白溶解性在成熟过程中的变化Fig. 5 Variation in collagen solubility of horsemeat with different electrical stimulation durations during aging

胶原蛋白溶解性反映了肉中可溶性胶原蛋白在总胶原蛋白中的含量高低，是体现由胶原蛋白构成的“背景嫩度”的重要指标[28]。对图5分析可知，电刺激处理时间在0～100 s范围内，随电刺激处理时间的延长，在成熟1 d和3 d时各处理组马肉的胶原蛋白溶解性间均不存在显著差异（P＞0.05）。在成熟7 d和14 d时，0 s与20 s处理组间不存在显著差异（P＞0.05）。而20 s与40、60、80、100 s处理组间均存在极显著差异（P＜0.01），说明在电刺激处理时间达到40 s以后，电刺激处理对马肉的胶原蛋白溶解性有显著影响。当电刺激40 s、成熟7、14 d时，马肉胶原蛋白溶解性分别达到对照组7 d和14 d时的1.36 倍和1.34 倍。同时，同一电刺激时间处理后，随成熟时间的延长，马肉的胶原蛋白溶解性呈显著上升趋势，分析表明，同一处理组的不同成熟时间之间，马肉胶原蛋白溶解性存在极显著差异（P＜0.01）。研究结果表明，电刺激处理可以降低胶原蛋白之间的交联度，进而提高可溶性胶原蛋白的含量，改善马肉的嫩度。

2.6 电刺激处理对宰后马肉成熟过程中超微结构的影响

图6 电刺激处理后马肉微观结构在成熟过程中的变化Fig. 6 Variation in microstructure of horsemeat with different electrical stimulation durations during aging

电刺激处理对肌原纤维造成了物理性破坏，产生大量的挛缩带和拉伸带，有利于提高肉的嫩度[29]。如图6所示，与对照组相比，经电刺激处理的宰后马肉在成熟过程中，肌束排列规则性更明显地发生了变化，同时肌纤维也发生了较明显的断裂。随着马肉的不断成熟，不规则排列越来越明显，肌纤维的断裂也更多。电刺激处理后的马肉，在成熟7 d和14 d时，肌纤维的小片化现象更加明显。由此可见，电刺激处理改变了马肉肌纤维排列结构，对肌纤维结构也造成了破坏。这与研究结果中电刺激处理使MFI上升相符。George等[18]研究发现，电刺激处理使牛肉肌浆网过量释放钙离子，从而产生挛缩带，破坏了肌纤维结构，使嫩度得到改善。

3 结 论

电刺激处理对马肉背最长肌的蒸煮损失率没有产生显著影响，但对马肉的剪切力、SPC、MFI和胶原蛋白溶解性都有明显影响。在一定电刺激处理时间范围内，由于电刺激处理加快了宰后马肉的糖酵解速率及肌原纤维与骨架蛋白的降解速度，降低了胶原蛋白之间的交联度，从而使马肉剪切力下降，SPC上升，MFI上升，胶原蛋白溶解性上升。电刺激60 s对马肉的嫩度提升具有较好的效果，进一步延长电刺激处理时间效果提升不明显。综上所述，适当的电刺激处理能够促进宰后马肉的成熟，使较为粗糙的马肉得到有效嫩化，且该方法便于操作，在马肉加工产业化方面具有广阔的市场前景。

参考文献：

[1] 王利, 钱泽涛. 马肉的生产加工现状及其发展趋势[J]. 肉类研究,2008, 22(9): 66-68.

[2] 巴吐尔·阿不力克木, 赵立男, 申萍. 贮藏温度对马肉不同部位嫩度变化的影响[J]. 食品工业科技, 2015, 36(4): 339-343.DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.065.

[3] 秦菊, 杨东树, 张晓红, 等. 伊犁地区马肉嫩度的测定与分析[J]. 新疆农业科学, 2014, 51(3): 577-582.

[4] 蒋小锋, 李芳, 任雯雯, 等. 木瓜蛋白酶结合滚揉处理对马肉嫩度的影响[J]. 食品与发酵工业, 2014, 40(12): 230-234. DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201412043.

[5] BONILAURI P, LIUZZO G, MERIALDI G, et al. Growth of Listeria monocytogenes on vacuum-packaged horsemeat for human consumption[J]. Meat Science, 2004, 68(4): 671-674. DOI:10.1016/j.meatsci.2004.05.014.

[6] IRENA S, JACEK K. Effect of horsemeat enrichment on autolytic changes in intramuscular lipids during cold storage[J]. Microbial Drug Resistance, 2000, 12(3): 164-168.

[7] HWANG I H, DEVINE C E, HOPKINS D L. The biochemical and physical effects of electrical stimulation on beef and sheep meat tenderness[J]. Meat Science, 2003, 65: 677-691. DOI:10.1016/S0309-1740(02)00271-1.

[8] TOOHEY E S, HOPKINS D L, STANLEY D F, et al. The impact of new generation pre-dressing medium-voltage electrical stimulation on tenderness and colour stability in lamb meat[J]. Meat Science, 2008,79(4): 683-691. DOI:10.1016/j.meatsci.2007.10.036.

[9] FERGUSON D M, JIANG S T, HEARNSHAW H, et al. Effect of electrical stimulation on protease activity and tenderness of M. longissimus from cattle with different proportions of Bos indicus content[J]. Meat Science, 2000, 55: 265-272. DOI:10.1016/S0309-1740(99)00131-X.

[10] POPHIWA P, WEBB E C, FRYLINCK L. Meat quality characteristics of two South African goat breeds after applying electrical stimulation or delayed chilling of carcasses[J]. Small Ruminant Research, 2016,145: 107-114. DOI:10.1016/j.smallrumres.2016.10.026.

[11] 罗欣, 周光宏. 电刺激和延迟冷却对牛肉食用品质的影响[J]. 中国农业科学, 2008, 41(1): 188-194.

[12] 张睿, 罗欣, 朱立贤, 等. 超低压电刺激和热剔骨工艺对牦牛肉品品质的影响[J]. 食品与发酵工业, 2014, 40(10): 213-218.DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.2014.10.076.

[13] 郎玉苗, 张睿, 谢鹏, 等. 电刺激和成熟对冷热剔骨牦牛肉品质的影响[J]. 中国食品学报, 2017, 17(3): 177-185. DOI:10.16429/j.1009-7848.2017.03.022.

[14] CULLER R D, PARRISH F C, SMITH G C. Relationship of myofibril fragmentation index to certain chemical, physical and sensory characteristics of bovine longissimus muscle[J]. Journal of Food Science, 1978, 43(4): 1177-1180. DOI:10.1111/j.1365-2621.1978.tb15263.x.

[15] HILL F. The solubility of intramuscular collagen in meat animals of various ages[J]. Food Science, 1966, 31(2): 161-166. DOI:10.1111/j.1365-2621.1966.tb00472.x.

[16] BERGMAN I, LOXLEY R. Two improved and simplified methods for the spectrophotometric determination of hydroxyproline[J]. Analytical Chemistry, 1963, 35: 1961-1965. DOI:10.1021/ac60205a053.

[17] NISHIMURA T, HATTORI A, TAKAHASHI K. Structural changes in intramuscular connective tissue during the fattening of Japanese black cattle, effect of marbling on beef tenderization[J]. Journal of Animal Science, 1999, 77(1): 93-104. DOI:10.2527/1999.77193x.

[18] GEORGE A R, BENDALL J R, JONES R C D. The tenderising effect of electrical stimulation of beef carcasses[J]. Meat Science, 1980, 4(1):51-68. DOI:10.1016/0309-1740(80)90023-6.

[19] HOPE-JONES M, STRYDOM P E, FRYLINCK L, et al. The efficiency of electrical stimulation to counteract the negative effects of β-agonists on meat tenderness of feedlot cattle[J]. Meat Science, 2010,86(3): 699-705. DOI:10.1016/j.meatsci.2010.06.008.

[20] ROSENVOLD K, NORTH M, DEVINE C, et al. The protective effect of electrical stimulation and wrapping on beef tenderness at high pre rigor temperatures[J]. Meat Science, 2008, 79(2): 299-306.DOI:10.1016/j.meatsci.2007.10.002.

[21] GURSANSKY B, O’HALLORAN J M, EGAN A, et al. Tenderness enhancement of beef from Bos indicus and Bos taurus cattle following electrical stimulation[J]. Meat Science, 2010, 86(3): 635-641.DOI:10.1016/j.meatsci.2010.05.002.

[22] 王莉, 王玉涛, 郭丽君, 等. 电刺激对宰后牦牛肉成熟过程中肌钙蛋白-T和肌间线蛋白及嫩度的影响[J]. 食品工业科技, 2017, 38(11):65-70; 75. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2017.11.004.

[23] 田园, 党欣, 韩玲, 等. 不同电刺激时间对牦牛肉在成熟过程中品质变化的影响[J]. 食品工业科技, 2014, 35(1): 56-60; 65.DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2014.01.053.

[24] 田园, 孙志昶, 余群力, 等. 低压电刺激对牦牛肉宰后成熟过程中嫩度及肌纤维超微结构的影响[J]. 食品科学, 2014, 35(7): 43-47.

[25] 贾青, 余群力, 田园, 等. 低压电刺激对不同部位宰后牦牛肉肌原纤维蛋白水解的影响[J]. 食品工业科技, 2015, 36(5): 53-57.DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.002.

[26] CONTRERAS-CASTILLO C J, LOMIWES D, WU G, et al. The effect of electrical stimulation on post mortem myofibrillar protein degradation and small heat shock protein kinetics in bull beef[J]. Meat Science, 2016, 113: 65-72. DOI:10.1016/j.meatsci.2015.11.012.

[27] 郑祖林, 韩玲, 余群力, 等. 电刺激对白牦牛不同部位肉品质及感官特性的影响[J]. 食品工业科技, 2014, 35(2): 131-135. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2014.02.080.

[28] 常海军. 不同加工条件下牛肉肌内胶原蛋白特性变化及其对品质影响研究[D]. 南京: 南京农业大学, 2010: 11.

[29] 毛衍伟. 快速冷却和电刺激对牛肉品质的影响及其机理研究[D]. 泰安: 山东农业大学, 2011: 59.