桔梗皂苷D对阿霉素体外抗肝癌活性的干预作用及其机制研究

郑璟瑶 徐广涛

由于肝癌的恶性程度高，肝癌细胞的转移能力很强，因此肝癌的致死率很高，患者预后差[1]。阿霉素（多柔比星）是一种抗肿瘤抗生素，具有广谱的抗肿瘤活性，在肝癌的化疗中具有重要的作用，能明显抑制肝癌细胞中DNA的复制和修复，从而诱导肿瘤细胞发生凋亡[2-3]。然而大剂量使用阿霉素的毒副反应，特别是对心脏的毒性也很大[4-5]。因此，采取辅助治疗方法提高肝癌细胞对阿霉素的敏感性，降低其使用剂量具有十分重要的意义。本研究观察桔梗皂苷D对阿霉素体外抗肝癌活性的干预作用并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 RPMI-1640培养基购于美国Gibco。Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒（货号：APOAF）、噻唑蓝（MTT）、二氢乙啶（DHE）、桔梗皂苷D、N-乙酰半胱氨酸（NAC）和阿霉素购于美国Sigma-Aldrich。ASK1抗体、磷酸化ASK1抗体和ASK1小干扰RNA购于美国Santa Cruze。活化型Caspase-3抗体、磷酸化JNK抗体和GAPDH抗体购于美国Cell Signaling。增强型化学发光底物（ECL）试剂盒（批号：32106）购于美国Pierce。脂质体2000（Lipofectamine 2000）购于美国 Invitrogen。

1.2 细胞培养 人肝癌细胞系PLC购于中科院上海细胞库。细胞培养在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，培养环境为37°C恒温培养箱中培养并通入5%CO2。

1.3 细胞活力检测 将PLC细胞按5×103/孔接种在96孔板上，分为对照组、桔梗皂苷D组、阿霉素组、阿霉素+桔梗皂苷D组、阿霉素+桔梗皂苷D+NAC组和阿霉素+桔梗皂苷D+ASK1小干扰RNA组。对照组为PLC细胞不加药物培养48h，阿霉素组为在PLC细胞中加入0.5μmol/L的阿霉素培养48h，桔梗皂苷D组为在PLC细胞中加入1μmol/L的桔梗皂苷D培养48h，阿霉素+桔梗皂苷D组为在PLC细胞中加入0.5μmol/L的阿霉素和1μmol/L的桔梗皂苷D培养48h，阿霉素+桔梗皂苷D+NAC组为在PLC细胞中加入0.5μmol/L的阿霉素、1μmol/L的桔梗皂苷D和2mmol/L NAC培养48h，阿霉素+桔梗皂苷D+ASK1小干扰RNA组为先将50ρmol/mL的ASK1小干扰RNA转染入PLC细胞中培养24h，之后更换培养基再加入0.5μmol/L的阿霉素和1μmol/L的桔梗皂苷D继续培养48h。药物处理完毕后在PLC培养孔中加入20μL 5mg/mL MTT再培养4h，小心吸去上清液，往孔中加入150μL二甲亚砜，充分震荡后在570nm波长下用酶标仪检测OD值，PLC细胞活力抑制率用以下公式计算：抑制率=（OD对照组-OD药物处理组）/OD对照组×100%。

1.4 细胞凋亡 将PLC细胞按2×106/孔接种在6孔板上，按上述进行分组处理。处理完毕后按照Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒说明书用Annexin-V对细胞进行染色孵育20min。之后采用流式细胞术检测PLC细胞的凋亡，凋亡率用Annexin-V阳性细胞数占总细胞数的百分比表示。

1.5 ROS测定 将细胞按2×106/孔接种在6孔板上，按上述进行分组处理。药物处理完毕后在PLC细胞中加入5μmol/L DHE暗室孵育20min。之后采用流式细胞术检测PLC细胞活性氧（ROS）的产生。由于DHE在ROS的氧化作用下能发出红色荧光，因此PLC细胞发出的红色荧光越强则ROS水平越高[6]。

1.6 Western blot 将细胞按2×106/孔接种在6孔板上，按上述进行分组处理。药物处理完毕后将细胞用蛋白提取液提取总蛋白质。之后将提取的总蛋白质用12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。分离完毕后通过电转方法将蛋白质从分离胶上转到醋酸纤维素膜上，用ASK1抗体、磷酸化ASK1抗体、活化型Caspase-3抗体、磷酸化JNK抗体或GAPDH抗体孵育过夜，之后再用带辣根过氧化物酶的二抗孵育2h，蛋白条带用ECL试剂盒显色发光。

1.7 统计学方法 实验重复3次，实验数据用均数±标准差（±s） 表示并用SPSS14.0统计软件进行处理，组间均数的比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组PLC细胞的细胞活力抑制率和凋亡诱导率比较 MTT和流式细胞实验结果显示，阿霉素+桔梗皂苷D组PLC细胞的细胞活力抑制率和凋亡诱导率均显著高于阿霉素组和桔梗皂苷D组（P均＜0.05），见表 1。

表1 各组PLC细胞的细胞活力抑制率和凋亡诱导率比较（%±s）

表1 各组PLC细胞的细胞活力抑制率和凋亡诱导率比较（%±s）

注：与阿霉素组比较，▲P＜0.05；与桔梗皂苷 D 组比较，△P＜0.05；与阿霉素+桔梗皂苷D组比较，*P＜0.05

组别对照组阿霉素组桔梗皂苷D组阿霉素+桔梗皂苷D组阿霉素+桔梗皂苷D+NAC组阿霉素+桔梗皂苷D+ASK1小干扰RNA组孔数333333细胞活力抑制率0 15.2±1.4 7.2±0.5 61.5±5.1▲△25.8±2.0*19.7±1.6*凋亡诱导率1.7±0.2 7.6±0.6 2.9±0.3 36.8±2.9▲△12.4±1.1*10.8±0.9*

2.2 各组PLC细胞ASK1表达水平比较 Western blot实验结果显示，桔梗皂苷D处理能明显增加PLC细胞ASK1的表达水平，而阿霉素处理对ASK1的表达水平无影响。阿霉素能诱导ASK1发生磷酸化，而桔梗皂苷D虽不能直接诱导ASK1的磷酸化，但能促进阿霉素依赖的ASK1磷酸化水平（见封四图1）。为了判断桔梗皂苷D发挥协同作用的机制是否与ASK1上调有关，本研究在PLC细胞中转染ASK1小干扰RNA以沉默ASK1基因。实验结果显示，转染ASK1小干扰RNA能显著减弱桔梗皂苷D联合阿霉素对PLC细胞活力的抑制和凋亡的诱导（P＜0.05）（见表1），表明桔梗皂苷D可能通过上调ASK1表达水平从而增强阿霉素依赖的ASK1的磷酸化，促进阿霉素对PLC细胞的杀伤活性。

2.3 阿霉素联合桔梗皂苷D对ROS/ASK1/JNK信号途径的影响 流式细胞实验结果显示，阿霉素处理能诱导PLC细胞ROS的产生，然而桔梗皂苷D对细胞内ROS的水平无影响（见封四图2）。将PLC细胞用ROS清除剂NAC[6]处理后，阿霉素联合桔梗皂苷D对ASK1磷酸化的诱导受到明显抑制（见封四图1），结果表明桔梗皂苷D联合阿霉素对PLC的杀伤活性依赖于ROS的产生，而ROS是ASK1的上游信号分子，桔梗皂苷D虽不能直接诱导ROS的产生，但能通过上调ASK1的表达增强阿霉素依赖的ROS/ASK1信号通路。Western blot实验结果显示，桔梗皂苷D联合阿霉素显著诱导PLC细胞JNK蛋白的磷酸化，但转染ASK1小干扰RNA后，桔梗皂苷D不能增强阿霉素依赖的PLC细胞中JNK蛋白的磷酸化（见封四图3），桔梗皂苷D联合阿霉素能显著诱导PLC细胞中凋亡执行分子Caspase-3活化，而转染ASK1小干扰RNA或采用NAC处理均能抑制Caspase-3活化（见封四图3），表明桔梗皂苷D联合阿霉素可能通过ROS/ASK1/JNK途径增强阿霉素对PLC细胞凋亡的诱导。

3 讨论

桔梗皂苷D是桔梗总皂苷的主要活性成分，具有抗炎、镇痛和免疫调节的作用。文献报道，桔梗皂苷D还具有一定的抗肿瘤活性，能促进肿瘤细胞的凋亡和周期阻滞[7-9]，然而其对化疗药物的协同抗肝癌活性至今仍很少报道。本研究发现，桔梗皂苷D联合处理能显著提高肝癌细胞对阿霉素的敏感性，表明桔梗皂苷D能作为一种辅助治疗药物增强阿霉素对肝癌的治疗效果，降低阿霉素的使用剂量。

ROS是诱导细胞发生凋亡的重要信号分子，阿霉素等化疗药物在很大程度上通过诱导肿瘤细胞中ROS的产生，进而诱发其发生凋亡性死亡而发挥抗肿瘤活性[10-11]。在ROS诱导的信号通路中，JNK是激活细胞凋亡的重要下游分子，ROS通过激活ASK1蛋白的磷酸化诱导JNK的活化，而活化的JNK能诱导肿瘤细胞中促凋亡蛋白的表达从而诱导凋亡的发生[12-14]。本研究发现，阿霉素联合桔梗皂苷D对肝癌细胞的杀伤活性依赖于细胞ROS的产生。桔梗皂苷D发挥协同作用的机制可能是其能上调肝癌细胞ASK1蛋白表达，从而促进阿霉素诱导产生ROS对ASK1蛋白的磷酸化，ASK1蛋白磷酸化又激活JNK的活化，从而使肝癌细胞发生了JNK依赖的细胞凋亡。

综上所述，桔梗皂苷D对阿霉素有协同抗肝癌效应。桔梗皂苷D可能通过上调ASK1表达促进阿霉素诱导肝癌细胞发生凋亡性死亡。

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