隐丹参酮联合顺铂抗非小细胞肺癌NCI-H1975细胞JAK2/STAT3机制研究

雷俊华 许冠华 曾江正 黄 芬 何志惠 卢彦达

顺铂是周期非特异性抗肿瘤药物，适用于多种恶性肿瘤的化疗，长期以来作为一线化疗药物应用于临床，但其毒副作用和多次使用后出现的耐药性限制了其在临床的应用。采用中药联合化疗是中国治疗肿瘤的独特治疗模式，众多研究表明隐丹参酮具有抗肿瘤活性，联合放化疗可以起到增效减毒的作用[1-2]。但其联合抗肿瘤作用机制尚不清楚。本文以非小细胞肺癌NCI-H1975细胞为研究对象，探讨隐丹参酮联合顺铂在非小细胞肺癌NCI-H1975细胞中的作用及其机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂

隐丹参酮、顺铂、非小细胞肺癌NCI-H1975细胞、CCK-8试剂盒、多克隆兔一抗Bcl-2、Survivin、STAT3、JAK2、Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase9；多功能全波长酶标仪、蛋白印迹检测系统、流式细胞仪、凝胶成像系统、激光共聚焦显微镜。

1.2 方法

1.2.1 非小细胞肺癌NCI-H1975细胞培养 NCI-H1975细胞培养于含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素及100 U/mL链霉素的RPMI1640培养基中，培养于37℃、90%湿度、5%CO2的培养箱中，隔天换液，待细胞生长至80%～90%时，用0.1%胰酶消化并传代，选取对数生长期的NCI-H1975细胞用于后续实验。

1.2.2 CCK-8法检测用药后NCI-H1975细胞增殖抑制的作用 取对数生长期的NCI-H1975细胞，制备成单细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中(4×103个/孔)，待细胞贴壁后弃去培养液，试验分为4组：(1)对照组，细胞培养不加药物；(2)隐丹参酮组，加入浓度为10 μM的隐丹参酮；(3)顺铂组，加入浓度为5 μg/mL的顺铂；(4)隐丹参酮联合顺铂组(以下简称联合用药组)，加入浓度为10 μM的隐丹参酮和浓度为5 μg/mL的顺铂，各组设置6个复孔，待药物作用12、24、48和72 h后，分别加入CCK-8试剂10 μL/孔，37℃、5% CO2培养箱孵育2 h，用酶标仪测定490 nm的吸光度(OD)值，实验重复3次，按照以下公式计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=[(对照组OD值-药物处理组OD值)/对照组OD值]×100%，实验重复3次[3]。

1.2.3 流式细胞术定量隐丹参酮联合顺铂对NCI-H1975细胞增殖抑制率 取对数生长期的NCI-H1975细胞，接种于6孔细胞培养板中(2×105个/孔)，培养24 h后细胞完全贴壁，药物作用24 h后收集各组细胞，用冷PBS洗细胞两次，离心1 000 r/min 5 min，加入500 μL的Binding Buffer重悬后加入 5μL AnnexinV FITC和5 μL PI混匀后，室温下避光反应5～15 min，1 h内流式细胞仪检测细胞凋亡率，实验重复3次。

1.2.4 Western blot法检测药物作用于NCI-H1975细胞后凋亡蛋白的表达 取对数生长期的NCI-H1975细胞，药物作用24 h后收集细胞，加入细胞裂解液，冰上放置30 min，每10 min振荡一次，离心12 000 rpm/min 5 min，取上清，以BSA法作蛋白定量后置，-30℃贮存备用。灌制10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶，常规电泳，转膜，封闭，一抗(1∶1 000)，4℃孵育过夜，二抗(1∶1 000)，室温孵育2 h，ECL显色。检测Bcl-2、Survivin、Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9凋亡标记蛋白表达水平，STAT3及JAK2蛋白表达水平和磷酸化水平，β-Actin作为内参，Quantity one软件进行蛋白条带的灰度值检测。以目的蛋白与内参蛋白条带的灰度值之比表示目的蛋白的相对表达情况。实验重复3次。

1.2.5 NCI-H1975细胞STAT3细胞定位和转录活性的检测 药物作用于细胞24 h后，经4%多聚甲醛固定30 min、0.1%X-Triton细胞膜通透10 min、5%BSA封闭1 h，一抗兔STAT3磷酸化Tyr705(1∶100稀释)室温避光孵育2 h。PBS洗涤三次，罗丹明标记羊抗兔二抗(1∶100)孵育2 h。PBS洗涤3次，DAPI染核5 min后封片。激光共聚焦检测STAT3在胞浆和胞核定位情况。

将STAT3荧光素酶报告基因载体和海肾荧光素酶表达载体共转染非小细胞肺癌细胞NCI-H1975，药物作用24 h，加入裂解液裂解30 min，离心取上清，荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性，海肾荧光素酶的活性作内参。每组样本检测3复孔，取平均值。实验重复3次。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 隐丹参酮联合顺铂对非小细胞肺癌NCI-H1975细胞增殖的影响

随着时间的延长，单药组及联合用药组细胞存活率均低于对照组(P<0.05)，与对照组及单药组相比，联合用药组在各时间点均明显抑制NCI-H1975细胞增殖活性(P<0.05)(图1)。

2.2 药物作用于NCI-H1975细胞24 h后的细胞存活情况

顺铂组的细胞存活率为(70.70±2.04)%，隐丹参酮组细胞存活率为(77.80±3.25)%，联合用药组细胞存活率为(47.77±5.06)%，顺铂组、隐丹参酮组及联合用药组细胞存活率均低于对照组(P<0.05)，联合用药组细胞存活率显著低于单药组(P<0.05)(图2)。

2.3 药物作用于NCI-H1975细胞后相关蛋白变化

与对照组和单药组对比，联合用药组作用于NCI-H1975细胞24 h后，抗凋亡蛋白Bcl-2、Survivin表达水平下降，Cleaved-caspase 3和Cleaved-aspase 9蛋白表达增加(P<0.01)(表1，图3)。

图1 CCK-8法隐丹参酮联合顺铂对非小细胞肺癌NCI-H1975细胞增殖的影响Figure 1 The effect of cryptotanshinone combined with cisplatin on the proliferation of non small cell lung cancer NCI-H1975 cells was detected by CCK-8 assay Note：*P<0.05，compared with the control group；#P<0.05，compared with the single drug groups.

图2 FCM法检测药物作用于NCI-H1975细胞的后的细胞存活情况Figure 2 The survival rates of NCI-H1975 cells treated with cryptotanshinone，cisplatin or their combination were detected by FCM assay

GroupBcl-2/β-ActinSurvivin/β-ActinCle-caspase3/β-ActinCle-caspase9/β-Actinp-JAK/β-Actinp-STAT3/β-ActinCtrl1.15±0.070.92±0.030.06±0.020.07±0.011.52±0.031.43±0.09CPT0.91±0.04*0.84±0.04*0.26±0.03*0.29±0.01*1.05±0.08*1.12±0.03*DDP0.74±0.04*0.69±0.04*0.46±0.04*0.48±0.04*0.81±0.03*0.84±0.07*DDP+CPT0.48±0.03*#0.51±0.02*#0.79±0.05*#0.64±0.05*#0.34±0.07*#0.42±0.08*#

Note：*P<0.01，compared with the control group；#P<0.01，compared with the single drug groups.

Western blot法进一步检测发现，与对照组及单药组相比，联合用药组信号通路中JAK2、STAT3蛋白表达水平无明显变化，但其磷酸化表达水平明显下降(P<0.01)(图4)。

2.4 隐丹参酮联合顺铂对NCI-H1975细胞STAT3转录情况及转录活性的影响

联合用药组作用于NCI-H1975细胞，激光共聚焦显示细胞核内的亮度明显降低，提示核内STAT3明显减少；荧光素酶进一步检测药物作用于细胞后，提示联合用药后核内的STAT3活性降低明显，与对照组及单药组比较，差异有统计学意义(P<0.05)(图5，6)。

图3 药物作用于NCI-H1975细胞后凋亡相关蛋白及抗凋亡蛋白表达情况Figure 3 The expression of cleaved caspase-3，9，Bcl-2，Survivin and β-Actin protein in NCI-H1975 cells treated with cryptotanshinone，cisplatin or their combination

图4 免疫印迹技术检测药物作用于NCI-H1975细胞后STAT3及其磷酸化水平的表达Figure 4 The expression level of STAT3 protein in NCI-H1975 cells treated with cryptotanshinone，cisplatin or their combination

图5 激光共聚焦检测隐丹参酮联合顺铂对NCI-H1975细胞STAT3转录情况Figure 5 The translocation of STAT3 in the nucleus of NCI-H1975 cells treated with cryptotanshinone，cisplatin or their combination

图6 荧光素酶检测隐丹参酮联合顺铂对NCI-H1975细胞STAT3转录活性的影响Figure 6 The transcriptional activity of STAT3 in NCI-H1975 cells treated with cryptotanshinone，cisplatin or their combinationNote：*P<0.05，vs. Ctrl group；#P<0.05，vs. single drug group.

3 讨论

肺癌发病率及死亡率居恶性肿瘤首位，发病早期临床症状缺乏特异性，大多数患者确诊时，病情已为中晚期，错过了手术治疗时机。临床上中晚期肺癌以铂类为主的两药联合方案化疗为主要治疗手段之一[4]。顺铂作为主要铂类用药，其在肺癌中的有效性得到了广泛的验证，但其大剂量使用所产生的副作用也一直困扰着临床医生。寻找一种药物可协同顺铂抗肿瘤，从而降低顺铂使用剂量是解决该困惑的主要手段之一。

隐丹参酮是从丹参中提取的一种成分，与细胞毒性的化疗药相比较，其对人体的毒副作用少，并具有杀伤肿瘤细胞的作用，已被证实对肺癌有抑制生长的作用[5]。但与顺铂联合应用是否可协同抗肿瘤作用及其作用机制鲜少见报道。

本课题的目的是研究隐丹参酮联合顺铂具有协同抗肿瘤效应及其可能的机制，该研究结果提示随着时间的延长，隐丹参酮、顺铂组及联合用药组肺癌细胞存活率均低于对照组。与对照组及单药组相比，联合用药组在各时间点均明显抑制NCI-H1975细胞增殖活性，结果提示顺铂、隐丹参酮对肺癌细胞均有抑制作用，两药联合作用于NCI-H1975细胞，抑制作用进一步加强，提示隐丹参酮联合顺铂抗肿瘤效果增加。

细胞凋亡受阻和过度增殖是导致肿瘤发生发展的重要原因，在细胞凋亡过程中，Caspase家族和Bcl-2基因家族发挥着重要的调控作用。Caspase3和Caspase9是Caspase家族中重要成员[6]，Caspase9是内源性凋亡途径中的一个中间执行者，Caspase9接受细胞色素C诱导的死亡信号，进一步激活下游执行型Caspase3，启动Caspase级联反应，导致细胞凋亡。Bcl-2可直接与凋亡刺激因子结合抑制Caspase3的激活，从而表现出抑制细胞凋亡的作用[7]。正常情况下，Caspase3和Caspase9为无活性的蛋白酶原，受细胞内外信号刺激后，剪切为Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9后被激活。survivin蛋白可能通过Caspase家族抑制凋亡或可能通过抑制细胞色素C的释放在线粒体水平参与抗凋亡[8]。那么隐丹参酮联合顺铂作用于非小细胞肺癌NCI-H1975细胞是否也能下调抗凋亡蛋白Bcl-2、Survivin的表达，激活Caspase 3和Caspase 9活性，而起到抗凋亡的作用呢？本研究结果显示，隐丹参酮联合顺铂作用于NCI-H1975细胞24 h后，抗凋亡蛋白Bcl-2，Survivin表达水平明显下降，Caspase 3和Caspase 9活性明显提高。说明两药联合抗肿瘤的机制可能与下调抗凋亡蛋白Bcl-2及Survivin有关。

JAK蛋白家族是一类非受体型酪氨酸激酶，分4个亚型，STAT家族是其下游信号蛋白，JAK2和STAT3作为JAK/STAT信号通路的重要成员，主要参与细胞增殖、分化、凋亡以及免疫调节等过程[9]。在正常组织中JAK2/STAT3信号通路受到严密的调控，STAT处于失活状态，而在肿瘤细胞中被异常激活而高表达[10-11]。而且该信号通路在肺癌发生发展中同样发挥重要作用，抑制该通路可明显降低肺癌细胞的增殖[12]。

本研究发现，隐丹参酮联合顺铂作用于非小细胞肺癌NCI-H1975细胞后，STAT3及JAK2蛋白表达水平无明显变化，但其磷酸化表达水平下降。进一步应用激光共聚焦显示细胞核内的亮度明显降低，提示核内STAT3明显减少；荧光素酶显示隐丹参酮联合顺铂作用后核内的STAT3活性降低，说明隐丹参酮联合顺铂可抑制信号通路中JAK2和STAT3磷酸化水平，提示抑制JAK2/STAT3信号通路的磷酸化，可促进非小细胞肺癌NCI-H1975细胞的凋亡。

综上所述，隐丹参酮和顺铂单独和联合作用处理非小细胞肺癌NCI-H1975细胞株，与单一药物作用相比，联合用药对肺癌细胞有更明显的抑制作用。此结果为隐丹参酮作为顺铂的化学敏化剂提供理论依据。其机制与抑制信号通路JAK2/STAT3磷酸化，下调抗凋亡蛋白Bcl-2和Survivin的表达，提高Caspase 3和Caspase 9活性有关。基于隐丹参酮对顺铂治疗肺癌患者具有化疗增敏性，故有望成为肺癌患者治疗的重要辅助用药。