MicroRNA-150对上皮性卵巢癌细胞增殖、凋亡和侵袭转移能力的影响

李文辉 吕博文 钱 钧 苏丽菊 杨桐树 钱景荣 王 杰

卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，在女性癌症相关死亡原因中位居第四。由于缺乏有效的早期筛查手段，早期症状及临床表现不典型，约85%的患者初诊时已属疾病晚期错过手术治疗的最佳时期。最新统计资料显示[1-3]，近10年来，卵巢癌患者死亡率仍然较高，5年生存率没有明显改善。上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancer，EOC)是卵巢癌中最常见也是死亡率最高的病理类型，其死亡率高于其他各类妇科肿瘤之和[4-5]。截止目前，上皮性卵巢癌发生进展中的分子机制仍不完全清楚，给卵巢肿瘤的早期诊断带来困难和挑战。因此，寻找与上皮性卵巢癌发生及进展相关的关键因子，对提高上皮性卵巢癌患者生存率至关重要。

MicroRNA(miRNA)是新发现的一类长度为19～25个核苷酸的小的非编码RNA，其通过与目标信使RNA(mRNA)3′UTR区不完全结合，在转录后水平调控基因表达[6-7]。miRNA参与调控机体多种生理和病理过程。越来越多的证据表明，它们与肿瘤发生发展及侵袭转移有着密切的关系。一些miRNA，如miR-455、miR-494、miR-520b，可作为癌基因或抑癌基因在上皮性卵巢癌的发生发展中发挥作用[8-10]。研究发现，miR-150在上皮性卵巢癌组织中存在差异表达，可能是潜在的调控分子[11]，但miR-150对上皮性卵巢癌细胞增殖、凋亡和侵袭转移能力的影响目前尚不清楚。本研究拟采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)方法检测miR-150在正常卵巢上皮细胞和上皮性卵巢癌细胞中的表达差异及其对上皮性卵巢癌细胞增殖、凋亡和侵袭转移能力的影响。

1 材料与方法

1.1 一般资料

细胞总RNA提取试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；LipofectamineTM2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；Quant一步法逆转录荧光定量试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；MTT试剂盒购自美国Promega公司；流式细胞术所用FITC标记的Annexin V-PE/7-AAD双染细胞凋亡检测试剂盒购自美国BioLegend公司；Transwell实验相关试剂购自南京凯基生物科技发展有限公司；人正常卵巢上皮细胞系T29胞、上皮性卵巢癌细胞系A2780和OVCAR3细胞均购自中国科学院上海细胞库。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、转染及分组 人正常卵巢细胞(T29)和上皮性卵巢癌细胞(A2780，OVCAR3)置于含10%胎牛血清、1%青链霉素的RPMI-1640培养基中，37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。当上皮性卵巢癌细胞密度达到约70%后，将miR-150无义序列(miR-150NC)和miR-150类似物(miR-150mimic)经LipofectamineTM2000转入细胞中，具体操作步骤参见脂质体2000(LipofectamineTM2000)试剂说明。将细胞分为3组：Blank组(空白对照组)、miR-150 NC组(转染miR-150NC细胞组)及miR-150 mimic组(转染miR-150 mimic细胞组)。

1.2.2 qRT-PCR实验 按照细胞总RNA提取试剂盒说明书所述方法提取各实验组细胞，然后采用Quant一步法逆转录-荧光定量试剂盒所述方法行qRT-PCR，具体步骤如下：按说明书所述依次加入试剂后行一步法qRT-PCR。qRT-PCR反应条件为：50℃ 30 min，95℃ 2 min，35个循环94℃ 20 s，60℃20 s，65℃ 20 s。

1.2.3 MTT实验 细胞转染48 h后，取对数生长期的上皮性卵巢癌细胞，制备单细胞悬液，以5.0×103个/孔细胞密度接种于96孔板，设置miR-150 mimic组、miR-150 NC组、Blank组三组，每组设8个复孔。分别培养1～3 d，每孔加入20 μL浓度为1.5 mg/mL的MTT，培养4 h后每孔加入150 μL DMSO，读取吸光度值，绘制细胞生长曲线。

1.2.4 流式细胞术实验 取转染48 h后的各组细胞，5 mL PBS洗涤，1000 r/min离心5 min，5 mL PBS洗涤3次后，弃上清液；加入100 μL流式洗液，FITC标记的Annexin-V和7-AAD各10 μL及同型对照抗体，避光反应10 min后，加入400 μL流式洗液，200目尼龙膜过滤细胞后立即用流式细胞仪上机检测。细胞凋亡数据后期采用Flowjo7.2软件进行分析。

1.2.5 Transwell实验 收集培养的各组细胞，以2×108个细胞接种于Matrigel胶包被的Transwell小室，37℃培养24 h。取出小室，去除滤膜上室面的细胞和Matrigel胶，将细胞与1%多聚甲醛混合固定后染色，用显微镜计数进入膜下的细胞数，进行统计分析。实验重复3次，取平均值。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 上皮性卵巢癌细胞和正常卵巢上皮细胞中miR-150的表达差异

qRT-PCR结果显示，上皮性卵巢癌细胞系A2780和OVCAR3中miR-150的表达量分别为(A2780：0.41±0.05；OVCAR3：0.34±0.07)，明显低于正常卵巢上皮细胞系T29(1.79±0.23)，差异均有统计学意义(P<0.01)(图1)。

2.2 miR-150 mimic上调上皮性卵巢癌细胞中miR-150的表达

在转染48 h后，qRT-PCR结果显示miR-150 mimic组 miR-150 的相对表达量明显高于Blank组和miR-150 NC组，差异有统计学意义(P<0.01)，且miR-150 NC组与Blank组之间miR-150相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)，结果提示转染miR-150 mimic可上调上皮性卵巢癌细胞中 miR-150 的表达水平(图2)。

图1 正常人卵巢上皮细胞T29和上皮性卵巢癌细胞A2780、OVCAR3中miR-150的相对表达水平Figure 1 The expression of miR-150 in human ovarian epithelial T29 cells and epithelial ovarian cancer(A2780 and OVCAR3)cellsNote：**P<0.01，compared with the T29 cells group.

图2 细胞转染后miR-150的相对表达水Figure 2 The expression of miR-150 in A2780 and OVCAR3 cells after miR-150 mimic transfectionNote：**P<0.01，compared with the Blank and miR-150 NC groups.

2.3 miR-150对上皮性卵巢癌细胞增殖的影响

为研究miR-150对上皮性卵巢癌细胞增殖能力的影响，利用MTT实验检测各处理组细胞的增殖差异。结果显示，miR-150 mimic组细胞OD值在各时间点均较miR-150 NC组及Blank组降低，转染后第三天，miR-150 mimic组OD值(A2780：1.12±0.03；OVCAR3：1.91±0.03)明显低于Blank组(A2780：2.35±0.09；OVCAR3：2.63±0.07)和miR-150 NC组(A2780：2.18±0.07；OVCAR3：2.43±0.11)，差异有统计学意义(P<0.05)，Blank组与miR-150 NC组OD值相比较差异无统计学意义(P>0.05)。结果提示，提高上皮性卵巢癌细胞中miR-150的表达可抑制上皮性卵巢癌细胞的增殖(图3)。

2.4 miR-150对上皮性卵巢癌细胞凋亡的影响

为研究miR-150对上皮性卵巢癌细胞凋亡水平的影响，利用流式细胞术检测各处理组细胞的凋亡情况的差异。结果显示，miR-150 mimic组细胞凋亡率(A2780：16.10±0.58%；OVCAR3：15.16±1.30%)明显高于Blank组(A2780：10.07±0.66%；OVCAR3：3.81±0.24%)和miR-150 NC组(A2780：10.36±1.08%；OVCAR3：4.89±0.07%)，差异有统计学意义(P<0.05)；Blank组与miR-150 NC组凋亡率相比较差异无统计学意义。结果提示，上调上皮性卵巢癌细胞中miR-150的表达水平可促进上皮性卵巢癌细胞的凋亡，进一步证实miR-150是潜在的肿瘤抑制分子(图4)。

2.5 miR-150对上皮性卵巢癌细胞侵袭转移能力的影响

为研究miR-150对上皮性卵巢癌细胞侵袭转移能力的影响，利用Transwell实验检测各处理组细胞侵袭转移能力的差异。结果显示，miR-150 mimic组穿膜细胞数(A2780：38.67±2.03；OVCAR3：28.67±2.03个)，明显低于Blank组(A2780：76.30±7.45；OVCAR 3：55.67±3.18个)和miR-150 NC组(A2780：74.33±5.78；OVCAR3：56.33±3.84个)，差异有统计学意义(A2780：F=14.49，P<0.01；OVCAR3：F=25.77，P<0.01)；Blank组与miR-150 NC组穿膜细胞数相比较差异无统计学意义。结果提示，上调上皮性卵巢癌细胞中miR-150的表达水平可抑制上皮性卵巢癌细胞的侵袭转移能力(图5)。

图3 miR-150表达水平对上皮性卵巢癌细胞增殖的影响Figure 3 Effects of miR-150 expression on the proliferation of epithelial ovarian cancer cellsNote：A.The proliferation of A2780 cell；B.The proliferation of OVCAR3 cell；*P<0.01，compared with the Blank and miR-150 NC groups.

图4 miR-150表达水平对上皮性卵巢癌细胞凋亡的影响Figure 4 Effects of miR-150 expression on apoptosis of epithelial ovarian cancer cellsNote：**P<0.01，compared with the Blank and miR-150 NC groups.

图5 miR-150表达水平对上皮性卵巢癌细胞侵袭转移的影响Figure 5 Effects of miR-150 expression on invasion and metastasis of epithelial ovarian cancer cellsNote：**P<0.01，compared with the Blank and miR-150 NC groups.

3 讨论

上皮性卵巢癌因其恶性程度高、缺乏有效早期检查手段，大部分患者发现时已处于疾病晚期，且5年生存率低，已经成为困扰妇科肿瘤治疗的主要问题之一。目前越来越多的证据显示，上皮性卵巢癌中存在多种差异表达的miRNA，这些差异表达的miRNA通过调节相应靶蛋白的表达参与肿瘤的发生发展，其中包括细胞增殖、凋亡及侵袭转移等过程[12-13]。因此，揭示上皮性卵巢癌中miRNA的作用及机制对克服这种致命疾病至关重要。

以往研究发现，miR-150在多种肿瘤中差异表达，通过参与肿瘤细胞多种生物学过程，影响肿瘤的发展。在甲状腺癌中，miR-150通过抑制RAB11A/WNT/β-连环蛋白途径在体内外抑制肿瘤生长[14]；在结肠癌中，miR-150通过靶向调节MUC4抑制结肠癌细胞的侵袭转移[15]；在原发性肝癌中，低水平的miR-150与肝癌患者预后较差显著相关[16]；在肺癌中高表达的miR-150抑制S激酶信号抑制剂1的表达，使得肺癌细胞增殖转移增加[17]；在宫颈癌中，miR-150通过靶向FOXO4促进癌细胞的生长[18]。

目前，miR-150在上皮性卵巢癌中的表达及功能研究较少。有研究显示，在上皮性卵巢癌组织中，miR-150表达水平较正常卵巢上皮组织降低[19]，但其对上皮性卵巢癌细胞生物学活性影响研究尚未见报道。本研究采用qRT-PCR、MTT、流式细胞技术、Transwell等方法，研究miR-150对上皮性卵巢癌细胞生物学活性的影响。与以往研究相符，miR-150在上皮性卵巢癌中表达下降；此外，上调miR-150表达后，通过观察上皮性卵巢癌细胞增殖、凋亡及转移侵袭能力我们发现，上皮性卵巢癌细胞增殖减少，凋亡增加，转移侵袭能力明显下降。由此我们推测：miR-150表达减少可能是上皮性卵巢癌发生、发展的机制之一；miR-150可作为抑癌基因，调控上皮性卵巢癌细胞增殖、凋亡及转移侵袭能力。

本研究目前仅在细胞水平验证了miR-150对上皮性卵巢癌细胞的抑制作用，下一步，我们将进行miR-150靶蛋白的验证，明确miR-150水平与上皮性卵巢癌患者临床进展及预后的关系；未来我们还将着重进行上皮性卵巢癌中miR-150失调机制的探讨。miR-150及其靶蛋白的相关研究有望为上皮性卵巢癌早期诊断、预后评估及临床治疗提供新的靶点。