右美托咪定对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护机制

张世平,王 臻,金梅梅,朱 婧,常建华

糖尿病是心血管疾病并发心肌梗死的高危因素之一，可显著增加心血管疾病的发病率及病死率[1-2]。近年来，多数学者认为，全麻常用药物对心肌缺血再灌注损伤(MIRI)有一定保护作用，但每种药物的保护机制各不相同[3-4]。右美托咪定是一种新型镇静药物，产生类似自然睡眠的镇静效果，且不会抑制呼吸，目前已在临床得到广泛应用[5-6]。有研究显示，炎性反应在MIRI发生、发展中起重要作用，右美托咪定可减轻氧化应激反应，抑制炎性细胞因子的释放，对MIRI有较好保护作用[7]。本研究拟通过建立糖尿病大鼠模型，旨在探讨右美托咪定减轻糖尿病大鼠MIRI的作用机制。现报告如下。

1 资料与方法

1.1实验材料 66只SPF级健康雄性SD大鼠，年龄约为10周龄，体重为190～210 g，由西安交通大学医学部动物实验中心提供，许可证号:SCXK(陕)2012-003；盐酸右美托咪定注射液(江苏恩华药业股份有限公司，产品批号：20170102，规格：2 ml：0.2 mg)；链脲佐菌素(上海如吉生物科技发展有限公司，产品编号：UM013，规格：100 ml)；伊文思蓝溶液(上海翊圣生物科技有限公司，产品编号：60528ES08，规格：5 g)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑溶液(上海沪震实业有限公司，CAS编号：298-96-4)。

1.2实验动物模型建立 将大鼠按随机数字表法分为正常组30只与糖尿病组36只，由专人分笼进行饲养，适应性自由进食4周后禁食、不禁水12 h，糖尿病组大鼠将链脲佐菌素50 mg/kg溶解于0.1 mmol/L枸橼酸钠-枸橼酸缓冲液(pH 4.2)中，经腹腔注射于大鼠体内，72 h后采尾静脉血测定血糖水平，若血糖≥16.7 mmol/L达1周并出现明显多尿、多饮症状者表示大鼠糖尿病模型造模成功，继续高脂高糖饲料喂养，期间每周测1次血糖，血糖不达标剔除实验，4周后最终36只糖尿病大鼠进入后期实验。正常组大鼠腹腔注射等量的缓冲液，普食喂养8周进入实验。

1.3大鼠MIRI模型的建立方法与分组 经腹腔注射1.5%戊巴比妥钠溶液0.005 ml/g，麻醉后记录标准Ⅱ导联心电图，行气管切开置管连接微型动物呼吸机行机械通气，呼吸频率为80～90/min，潮气量2 ml/100 g，吸呼比1∶2，同时记录心率及血压变化情况。沿胸骨左缘开胸，暴露心脏，剪开心包，在左心耳下缘与肺动脉圆锥间可见冠状动脉左前降支起始部，将备好的带线缝合针环绕左冠状动脉前降支根部穿线结扎，以生理盐水纱布覆盖，心电图可见ST段弓背向上抬高，提示结扎成功。缺血30 min后剪开结扎线，恢复血流使冠状动脉再灌注，可见左心室前壁转为红色，心电图可见抬高的ST段降低，提示再灌注成功，再灌注2 h后取出心脏，预冷生理盐水冲洗后滤纸吸干，称重全心质量[8]。将所选大鼠按随机数字表法分为假手术组、缺血再灌注组、右美托咪定组,每组10只，糖尿病假手术组、糖尿病缺血再灌注组、糖尿病右美托咪定组，每组12只。假手术组大鼠仅穿线而未结扎，缺血再灌注组与右美托咪定组大鼠均采用左前降支结扎30 min后再灌注2 h的方法建立MIRI模型。右美托咪定组大鼠在缺血前30 min经股静脉注射右美托咪定10 μg/kg，其余组大鼠在缺血前经股静脉给予等量生理盐水。

1.4观察指标

1.4.1心肌梗死面积的测量：于再灌注维持2 h时，再次结扎左冠状动脉前降支，于股静脉缓慢注入1 ml 1%伊文思蓝溶液，取出大鼠心脏，用预冷PBS溶液漂洗数次后将心脏放入-20℃冰箱冷冻2 h，沿心脏纵轴从心尖开始垂直将其均匀切成2 mm厚薄片，置于1% 2,3,5-氯化三苯基四氮唑溶液、37℃水浴箱(pH值7.4)中避光染色15 min，之后将心肌切片浸于4%多聚甲醛溶液中固定10 min。采用Image-J软件[9]测量相关区域面积，蓝色染色区域为正常心肌，灰白色染色区域为梗死区心肌(AN)，红色染色区域为缺血未梗死心肌(AAR)，每个处理组最终取5只大鼠心脏进行染色，计算并统计AN/AAR变化。

1.4.2大鼠实验室指标检测：大鼠于缺血再灌注2 h后从颈总动脉抽取3 ml动脉血置于肝素抗凝管内，在4℃条件中静置60 min后以3000 r/min的速度离心10 min，取上清液分装于Eppendorf管中并标记，置-80℃冰箱冷冻保存，待测。通过氧化酶法测定甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)水平，采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)水平，检测仪器为奥地利公司提供的型号为ANTHOSHT11的全自动酶标仪，具体操作方法严格按照试剂盒说明书进行。

2 结果

2.1一般情况比较 糖尿病组大鼠体质量、全心质量小于正常组，空腹血糖(FBG)、TC及TG水平高于正常组(P<0.01)。见表1。正常组大鼠饮食、饮水、尿量正常，毛发无改变；糖尿病组大鼠“三多”症状明显，毛发变黄且易脱落。

表1 正常组和糖尿病组大鼠一般情况比较

2.2血流动力学指标的比较 6组大鼠基线平均动脉压(MAP)、心率与心率收缩压乘积(RPP)水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；假手术组与糖尿病假手术组各时间段MAP、心率与RPP水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；除假手术组与糖尿病假手术组外，其余4组大鼠在缺血30 min与再灌注后MAP、心率与RPP水平低于基线(P<0.05)；与假手术组比较，缺血再灌注组与右美托咪定组大鼠在缺血30 min与再灌注后MAP、心率与RPP水平较低(P<0.05)；与糖尿病假手术组比较，糖尿病缺血再灌注组与糖尿病右美托咪定组大鼠在缺血30 min与再灌注后MAP、心率与RPP水平降低(P<0.05)；与缺血再灌注组比较，右美托咪定组大鼠在缺血30 min及再灌注后30 min时MAP、心率与RPP水平均降低，再灌注后120 min升高(P<0.05)；与糖尿病缺血再灌注组比较，糖尿病右美托咪定组大鼠在缺血30 min及再灌注后30 min时MAP、心率与RPP水平比较差异无统计学意义(P>0.05)，再灌注后120 min升高(P<0.05)。见表2。

2.3心肌梗死面积的比较 缺血再灌注组、右美托咪定组、糖尿病缺血再灌注组和糖尿病右美托咪定组AN/AAR分别为(43.47±1.12)%、(27.67±2.28)%、(46.36±1.18)%和(34.78±1.33)%。右美托咪定组AN/AAR低于缺血再灌注组，糖尿病右美托咪定组高于右美托咪定组，低于糖尿病缺血再灌注组(P<0.05)。

2.4血清TNF-α和IL-1β水平比较 糖尿病假手术组血清TNF-α和IL-1β水平与假手术组比较差异无统计学意义(P>0.05)；与假手术组比较，缺血再灌注组和右美托咪定组血清TNF-α和IL-1β水平较高(P<0.05)；与糖尿病假手术组比较，糖尿病缺血再灌注组与糖尿病右美托咪定组血清TNF-α和IL-1β水平较高(P<0.05)；与缺血再灌注组比较，右美托咪定组血清TNF-α和IL-1β水平降低(P<0.05)；糖尿病右美托咪定组血清TNF-α和IL-1β水平低于糖尿病缺血再灌注组(P<0.05)。见表3。

3 讨论

MIRI是心肌梗死的病理生理学基础之一。有研究报道，约75%的糖尿病患者死于冠状动脉阻塞性疾病，当糖尿病患者发生心肌梗死后，其心力衰竭发生率和病死率是非糖尿病患者的2～4倍[10]。由于糖尿病患者血糖水平较高，长时间的糖脂类物质代谢紊乱会激活体内炎性反应与氧化应激反应，从而导致多个脏器发生病理生理改变，其中心肌细胞结构和功能的改变最常见。MIRI的发生机制目前尚未阐明，主要认为是与氧自由基增加、心肌血流动力学改变、炎性反应等有关[11]。针对MIRI的发生机制，广大学者试图寻找抑制MIRI的方法。缺血预处理是20世纪80年代提出的概念，其被证实对MIRI有很好的保护作用，但其也是一种创伤性操作，由于伦理学限制，在临床应用并不广泛[12]。同时也有研究报道，并发糖尿病时，缺血预处理对MIRI的防护作用消失，故药物预处理对MIRI防治作用的研究日渐增多[13]。

表2 6组大鼠血流动力学指标的比较情况

注：MAP为平均动脉压，RPP为心率收缩压乘积；与基线比较，aP<0.05;与假手术组比较，cP<0.05;与糖尿病假手术组比较，eP<0.05;与缺血再灌注组比较，gP<0.05;与糖尿病缺血再灌注组比较，iP<0.05

表3 6组大鼠血清TNF-α和IL-1β水平的比较情况

注：TNF-α为肿瘤坏死因子-α，IL-1β为白介素-1β；与假手术组比较，aP<0.05;与糖尿病假手术组比较，cP<0.05;与缺血再灌注组比较，eP<0.05;与糖尿病缺血再灌注组比较，gP<0.05

近年来大量研究表明，临床常用的麻醉药物具有保护缺血心肌的作用，其中静脉麻醉药比吸入麻醉药的保护作用更强[7，14]。右美托咪定是一种高选择性α2肾上腺素受体激动剂，具有镇静、镇痛、抗焦虑、降低应激反应和稳定血流动力学等作用，且不存在呼吸抑制，在减轻MIRI方面有着广泛前景[15]。本研究结果显示，除假手术组与糖尿病假手术组外，其余4组大鼠在缺血后与再灌注后的MAP、心率与RPP水平低于基线水平，提示发生MIRI后，正常大鼠的心功能明显降低。右美托咪定组大鼠在缺血后及再灌注后30 min时MAP、心率与RPP水平均低于缺血再灌注组，再灌注后120 min时高于缺血再灌注组，提示通过右美托咪定预处理可以有效改善非糖尿病大鼠的心功能，对心肌有明显保护作用。同时也发现，糖尿病右美托咪定组在缺血后及再灌注后30 min MAP、心率与RPP水平与糖尿病缺血再灌注组比较差异无统计学意义，但在再灌注后120 min高于糖尿病缺血再灌注组，提示右美托咪定对糖尿病模型大鼠的心功能也有一定改善作用。

炎性反应是参与MIRI过程的机制之一，通过降低炎性细胞因子水平，抑制炎性反应，可以有效减少心肌梗死的面积，改善心功能[16-17]。TNF-α是活化的单核巨噬细胞产生的、一种能够直接杀伤肿瘤细胞的细胞因子，是炎性反应中出现最早的一种细胞因子，同时其对其他炎性因子的合成、释放有促进作用，当TNF-α浓度较高时，会增加血管内皮细胞的通透性，促进氧自由基生成，加重MIRI病情[18]。IL-1β是缺血再灌注损伤早期炎性介质，缺血再灌注可诱发心肌产生IL-1β，从而导致相关的急性炎性反应发生，同时IL-1β分泌也加重MIRI[19]。本研究结果显示，与缺血再灌注组比较，右美托咪定组血清TNF-α和IL-1β水平较低，提示右美托咪定可有效抑制正常大鼠MIRI引起的炎性反应，降低炎性因子水平。同时也发现，糖尿病右美托咪定组血清TNF-α和IL-1β水平均低于糖尿病缺血再灌注组，提示右美托咪定可有效抑制糖尿病大鼠MIRI引起的炎性反应，有抗炎作用。

心肌梗死面积可一定程度反映MIRI的损伤程度[20-21]。本研究结果显示，与缺血再灌注组比较，右美托咪定组大鼠的AN/AAR明显降低，提示右美托咪定可以明显缩小正常大鼠的心肌梗死面积，对非糖尿病大鼠的MIRI具有一定防护作用。同时也发现，与糖尿病缺血再灌注组比较，糖尿病右美托咪定组AN/AAR降低，提示右美托咪定对糖尿病大鼠的心肌梗死面积有缩小作用，说明在并发糖尿病的基础上，对大鼠的MIRI仍能起到一定的防护作用。

综上所述，对于非糖尿病大鼠，右美托咪定可以有效改善MIRI引起的血流动力学改变，降低炎性因子水平，抑制炎性反应，从而缩小心肌梗死面积，对大鼠的MIRI有明显防护作用。而对于糖尿病大鼠，右美托咪定对MIRI引起的血流动力学改变、炎性因子水平均有明显改善作用，且能缩小心肌梗死面积，故右美托咪定预处理对糖尿病大鼠MIRI亦有一定的防护作用。