神经生长因子及受体p75NTR在喉癌前病变及喉鳞状细胞癌组织中的表达及临床意义

申宇鹏，李晓明，靳海峰，贾立峰，陶振峰，宋 琦

喉腔是人体重要的组织器官，具有发音、呼吸、吞咽、防御等重要生理功能，喉部病变如未得到及时有效的治疗，往往会影响患者重要生理功能甚至危及生命，探索有效途径进行喉癌的综合辅助治疗成为头颈肿瘤相关研究热点[1]。喉癌及癌前病变的发生及恶性进展都处在机体生理环境中，受到内源性生长因子及相应受体调节网络的营养支持。围绕喉癌发病机制中表皮生长因子及其受体(epidermal growth factor receptor， EGFR)[2]、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)[3]、低氧诱导因子(HIF)[4]的作用都有研究报道。神经生长因子(nerve growth factor， NGF)归属神经营养素家族的成员，拥有酪氨酸蛋白激酶A(tyrosine kinase A， TrkA)及p75NTR受体，以往围绕神经生长因子及其受体的研究多限于神经系统[5-6]，在头颈鳞状细胞癌组织中的表达及相关研究少有报道。我们前期研究已经证实，TrkA受体的高表达与喉癌的恶性进展及淋巴结转移呈明显相关[7]。本研究针对NGF及p75NTR受体在喉癌前病变及喉癌组织中的表达进行分析探讨。

1 材料与方法

1.1标本来源及分组 标本选自解放军白求恩国际和平医院2006年7月—2009年7月经手术切除的喉鳞状细胞癌组织42例，喉不典型增生病变14例，喉乳头状瘤6例，取正常喉黏膜11例作为对照组。喉鳞状细胞癌组中男36例，女6例，平均年龄61岁。根据国际抗癌协会(UICC)标准(2002)划分TNM分期。依据病理学诊断结果分组:高分化组(鳞癌Ⅰ级)21例,中、低分化组(鳞癌Ⅱ级和Ⅲ级)21例;根据术后病理报告分组:伴颈部淋巴结转移组20例，无转移组22例。喉乳头状瘤组男6例，平均年龄53岁；不典型增生组男12例，女2例，平均年龄55岁；正常对照组男9例，女2例，平均年龄56岁。3组病例均经病理学诊断明确。3组性别、年龄比较差异无统计学意义(P<0.05)，具有可比性。所有标本均经4%多聚甲醛溶液固定24 h,石蜡包埋切片,切片厚5 μm,每例标本先经苏木精及伊红(HE)染色观察病理学特征,再进行免疫组化染色。

1.2抗体、试剂盒及仪器设备 p75NTR兔抗人单克隆抗体(ab52987)购自Abcam公司；Ki67单克隆抗体(sc-23900)及p63单克隆抗体(sc-8431)为Santa Cruz公司生产；β-NGF兔抗人多克隆抗体(bs-0067R)购自北京博奥森生物技术有限公司；即用型免疫组化试剂盒(SP-9002)及HRP-山羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物技术公司。荧光显微镜(DMIRB，德国Leica)；石蜡切片机(RM2135，德国Leica)；组织包埋机(EG1140C，德国Leica)。

1.3免疫组化染色 石蜡标本行连续切片，先经脱蜡及乙醇水化后高压抗原修复，然后给予免疫组化染色，采用常规SP法，将上述准备组织切片滴加3%过氧化氢溶液灭活过氧化物酶活性；山羊血清封闭非特异性显色；滴加一抗(p75NTR单克隆抗体稀释度1∶50)4℃孵育过夜；阴性对照组添加PBS抗体稀释液代替一抗；经二抗、辣根链霉素卵白素作用后行DAB显色，显色满意后给予苏木精复染，常规脱水、透明及中性树胶封片。

1.4结果判定 NGF阳性细胞的胞浆及胞核内显示棕黄色颗粒，p63及Ki67阳性显色基本位于胞核内。NGF染色评估标准：高倍镜下随机选取5个视野(每个视野观察细胞数≥150个)，按阳性细胞所占百分比及着色深浅度分别进行计分判定。①按视野中细胞着色深浅评分:细胞无显色(0分)，浅棕黄色(1分)，深棕黄色(2分)。②按阳性细胞数占同类细胞数百分比评分：<5%为0分，5%～20%为1分，20%～40%为2分，40%～60%为3分，<61%为4分。取①、②两项分值相加为最后得分：0～1分为阴性(-)，2～3分为弱阳性(+)，≥4分为强阳性(++)。

1.5统计学方法 采用SPSS 13.0软件进行数据分析，计数资料以率(%)表示，采用χ2检验。α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1正常喉黏膜中NGF及p75NTR的表达 正常喉黏膜的复层鳞状上皮主要包括：基底层、副基底层、棘状层、颗粒层、角质层。喉黏膜中NGF染色非常浅淡，阳性细胞呈胞浆浅淡着色，部分伴随胞核显色，NGF阳性细胞主要分布于黏膜的基底层、副基底层和棘状层，上棘状层及颗粒层罕见显色。参照预设评分标准，NGF表达分布与TrkA表达区域基本一致[7]，靠近黏膜表层着色浅淡。p75NTR阳性细胞主要为胞膜显色，部分细胞的胞浆也有显色。p75NTR仅表达于正常黏膜鳞状上皮的基底层细胞，其他黏膜上皮层均无显色。p75NTR阳性细胞于基底膜上方呈单排整齐排列，与下方间质组织分界清晰。p63阳性细胞主要分布于上皮的基底层和副基底层，胞核呈棕黄色，在黏膜基底层附近p63阳性细胞最密集。Ki67阳性细胞分布于副基底层附近，基底层无显色。相邻切片对比发现，p75NTR阳性染色严格分布于喉黏膜鳞状上皮的基底层，与上方的Ki67阳性细胞层紧密相贴(见图1，红色箭头标示阳性细胞)。

图1 正常喉黏膜中神经生长因子、p75NTR及相关蛋白的表达(DAB×200)

2.2喉不典型增生黏膜中NGF及p75NTR的表达 对经病理学证实的喉不典型增生黏膜进行染色，NGF及p75NTR的表达均高于正常喉黏膜。不典型增生黏膜中p75NTR染色的强阳性率为57.1%,p75NTR表达已不局限于基底层，在副基底层及周围层中也有分布，靠近基底部的染色较深，细胞膜及胞浆都有着色(图2A)。NGF计数强阳性率仅为14.3%，NGF表达升高表现为阳性着色加深及分布范围变广，重度不典型增生中NGF阳性细胞广泛分布至全层上皮，胞浆显色更加明显(图2B)。NGF染色与Ki67染色分布区域相近，形态学分析NGF及p75NTR的高表达与上皮细胞的高增殖活力相伴随(图2C)。

图2 喉部重度不典型增生黏膜中p75NTR、神经生长因子及Ki67的表达(DAB×200)

2.3喉乳头状瘤组织中NGF及p75NTR的表达 对病理学证实的7例喉乳头状瘤组织(4例发生癌变)做染色分析。喉乳头状瘤切片中p75NTR阳性细胞主要分布于肿瘤的基底细胞层，部分区域向上扩散至副基底层，阳性细胞的胞膜及胞浆均有着色，深染色区域集中于乳头状外向生长的基底部。NGF的表达在喉乳头状瘤组织中明显高于正常喉黏膜，乳头状瘤的肿瘤全层均可见NGF染色，细胞胞浆显色为主。我们观察到在乳头状瘤发生癌变的区域，NGF、p75NTR、Ki67表达均呈现明显上升，该区域p75NTR阳性染色范围扩大，细胞极性紊乱，提示乳头状瘤发生癌变的细胞存在高增殖活力。见图3。

图3 人乳头状瘤组织中p75NTR、神经生长因子及Ki67的表达(DAB×200)

2.4喉鳞状细胞癌组织中NGF及p75NTR的表达 喉鳞状细胞癌组织中，p75NTR的表达呈明显的区域性分布。分化程度较高的喉鳞状细胞癌组织中，p75NTR阳性细胞主要位于癌巢的周边基底层细胞，以胞膜显色为主，中央区细胞几乎无阳性染色(图4)，与p63的阳性分布区域基本接近。中分化喉鳞状细胞癌组织中，p75NTR阳性细胞分布由癌巢基底层及浸润缘扩展至周边范围(图5)。低分化喉鳞状细胞癌组织中，p75NTR阳性染色区更为广泛和分散，阳性细胞多数呈胞浆显色为主，缺失了分布区域性。低分化喉鳞状细胞癌中p75NTR阳性细胞虽然广泛分布，但是胞膜染色强度有所降低。高分化喉鳞状细胞癌中p75NTR阳性细胞多呈胞膜及胞浆显色，而低分化喉鳞状细胞癌中p75NTR阳性细胞少有胞膜深染，胞浆显色为主。形态学研究证实喉鳞状细胞癌组织中p75NTR阳性细胞的分布具有区域特异性。喉鳞状细胞癌组织中NGF阳性染色范围广泛，42例标本中仅3例(7%)呈阴性表达。多数标本中可见NGF阳性细胞分布于肿瘤各层，以胞浆阳性染色为主，NGF染色无明显区域性分布。与正常喉黏膜及乳头状瘤比较，喉鳞状细胞癌组织内NGF表达有所升高，强阳性率达52.4%。

图4 高分化喉鳞状细胞癌组织不同病理分级中p75NTR及神经生长因子的表达情况(DAB×200)

图5 中分化喉鳞状细胞癌组织p75NTR、p63及Ki67的染色(DAB×200)

2.5喉鳞状细胞癌组织中NGF的表达与颈部淋巴结转移的关系 将42例喉鳞状细胞癌标本根据颈部淋巴结术后病理学结果分为阳性淋巴结转移组20例和无淋巴结转移组22例，对2组切片的NGF表达情况进行染色对比分析。阳性淋巴结转移组中NGF染色强阳性15例(75.0%)，无淋巴结转移组为7例(31.82%)，阳性淋巴结转移组中NGF染色强阳性率高于无淋巴结转移组(χ2=6.025,P<0.05)。

3 讨论

NGF是神经营养素家族首要成员，其拥有Trks以及p75NTR。p75NTR是肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor, TNFR)家族成员之一，广泛分布于人体神经、上皮等组织系统及相应来源的肿瘤细胞中。研究表明，NGF等神经营养因子与其受体p75NTR和TrkA结合后，对组织细胞的生长、迁徙、分化及凋亡具有调节支持作用。近年来研究发现NGF与其受体p75NTR和TrkA之间相互调节，影响机体细胞及肿瘤细胞的生长、增殖、分化。机体内正常喉黏膜上皮由自然修复增生至恶变进展，要经过量变到质变的过程，即由正常上皮、上皮增生、不典型增生至喉癌。喉癌前病变为局部或环境因素长期刺激造成的喉黏膜形态变化，疾病的进展受到众多生长因子及受体信号途径的调节支持。以往关于NGF及p75NTR的研究大多限于神经系统，在喉黏膜、癌前病变及喉癌中的表达及功能情况少有研究报道。我们通过免疫组化观察NGF、p75NTR、Ki67等分子在喉黏膜、癌前病变及喉癌中的表达情况，为进一步研究该信号通路的功能奠定基础。

正常喉黏膜中NGF阳性染色主要分布于黏膜基底层、副基底层和棘状层，靠近黏膜表层几乎不显色。NGF阳性细胞的分布区域与TrkA阳性细胞分布区域基本一致。相比较p63阳性细胞主要分布于鳞状上皮的基底层、副基底层，分布范围比NGF更局限于基底部，但缺乏p75NTR表达的特异性。本研究结果显示，正常喉黏膜中p75NTR仅表达于基底层细胞，在基底层细胞上方的各细胞层中均未染色。p75NTR阳性细胞沿基底膜排列整齐，与下方结缔组织分界清晰。p63阳性细胞分布范围较p75NTR广泛，在靠近黏膜基底层周围p63阳性细胞最为密集。Ki67阳性染色细胞多数分布于副基底层周围，基底层没有显色。众所周知，Ki67阳性细胞具有旺盛的增殖活力。此外，p75NTR阳性细胞严格分布于Ki67染色区域相贴的下方基底层，符合黏膜上皮干细胞的特征。p75NTR阳性细胞具有自我更新、分化成熟的能力，其可作为正常喉黏膜鳞状上皮干细胞的良好标志物。

喉癌前病变是指临床表现具有恶变潜能的喉部病变，由多种临床症状、病理学特征和体征表现类似的疾病组成，主要包括：喉黏膜白斑病、喉角化病、喉乳头状瘤等。组织病理学表现为上皮单纯增生和不典型增生。经病理学证实的喉不典型增生黏膜中，NGF及p75NTR的表达均高于正常喉黏膜。不典型增生黏膜中p75NTR表达并不局限于基底层，在副基底层及周围层中也有分布，NGF阳性染色加深且分布范围变广。重度不典型增生中NGF阳性细胞广泛分布至上皮全层，与Ki67染色分布变化一致，形态学分析NGF及p75NTR的表达升高与上皮细胞的高增殖活力相伴随。乳头状瘤组织中p75NTR的深染色区域分布于肿瘤乳头状外向生长的基底层及副基底层。在乳头状瘤组织中，NGF表达高于普通黏膜上皮，特别是乳头状瘤发生癌变的区域，NGF、p75NTR及Ki67的表达水平相伴随上升，p75NTR阳性细胞区域增大，细胞极性紊乱，证实乳头状瘤发生癌变的区域细胞具备高增殖活力。

p75NTR受体是一种单链跨膜糖蛋白，胞内结构域包含:肿瘤坏死因子受体相关因子(TNF-receptor associated factor， TRAF)结合位点、Ⅱ型死亡结构域、G蛋白激活域等分子结构，p75NTR的胞内域有与受体功能无关的特殊结构，这些都成为p75NTR介导多重信号转导途径的基础[8]。近年来NGF及p75NTR受体在多种上皮及消化系统肿瘤中有相关研究报道，多数研究表明，p75NTR在肿瘤的发病及进展中具有重要作用，不同系统来源肿瘤中p75NTR受体通路的功能有明显差别。现有文献报道，在胃癌[9]、膀胱癌[10]、前列腺癌[11]中p75NTR受体通路具有抑制肿瘤生长增殖的作用。对黑色素瘤[12]、食管癌[13]、舌鳞癌等研究发现，p75NTR受体具备促进肿瘤生存进展的作用。p75NTR作为TNFR家族成员之一，具备抑制肿瘤细胞生长的结构基础，已知能够诱导激活下游凋亡信号通路。在对口腔鳞癌组织细胞中的研究发现，p75NTR表达的上调及其分布区域特征的改变能够预示患者治疗后复发及预后不良[14]。Kojima等[15]发现，p75NTR与食管鳞癌干细胞相关性密切。因此目前p75NTR在各类肿瘤中的功能尚未明确，p75NTR在不同肿瘤中发挥的作用与组织细胞类型、分化状态及微环境有关，同时也与细胞是否同时表达TrkA相关。

本研究发现，高分化喉鳞状细胞癌中p75NTR阳性细胞主要分布于肿瘤癌巢周边的基底层及与间质接触的浸润缘，与p63和Ki67的染色分布区域相接近，这些基底区及浸润缘的细胞具有较强的增殖和自我更新潜力。伴随分化程度的降低p75NTR分布范围更加广泛，逐渐缺失了分布区域性，阳性染色部位由胞膜向胞浆转化，半定量评分法尚难以分辨p75NTR表达与喉癌临床病理因素之间的关系，但我们推测胞浆内p75NTR表达上调与喉癌恶性进展有关联。目前有关NGF及p75NTR依赖的促生存机制并未阐明，p75NTR能与TrkA协同作用调节NGF依赖的TrkA活化途径，也可以通过自身信号通路来促进细胞增殖或诱导凋亡。p75NTR激活NF-κB途径促进细胞存活已在嗜铬细胞瘤PC12及泌乳素瘤细胞系中证实。已有研究支持TrkA受体对p75NTR受体的具体功能有直接影响，细胞中TrkA表达缺失时p75NTR能够激活自身信号途径，当同时表达TrkA受体时,p75NTR能够辅助并增强NGF及TrkA信号通路的功能[16]。在喉癌组织中NGF及TrkA蛋白的表达已被形态学研究证实，我们推测喉癌组织中自分泌或旁分泌的NGF与p75NTR及TrkA受体一起促进肿瘤细胞生长。本研究结果显示，阳性淋巴结转移组中NGF染色强阳性所占比例高于无淋巴结转移组，提示喉鳞状细胞癌组织中NGF表达的升高与颈部淋巴结转移相关，我们前期研究发现TrkA的高表达与喉癌颈部淋巴结转移相关，因此NGF及TrkA受体表达增高与喉癌淋巴结转移有关。

综上所述，NGF及p75NTR受体与喉癌的发病、生长及恶性进展密切相关，研究如何调控或阻断相关信号通路或许能够为我们治愈肿瘤提供新的思路。