微生态制剂对肝硬化门脉高压大鼠肠道四种微生物的影响

陈鉴

（绍兴第二医院，浙江 绍兴 312000）

肝硬化门脉高压患者肠道淤血缺氧，导致肠道微生态失衡。本实验采用大鼠肝硬化门脉高压模型观察大鼠肠道四种微生物（乳酸杆菌、双歧杆菌、大肠杆菌、真菌）的变化，以初步评价微生态制剂对肝硬化门脉高压大鼠肠道微生态的作用，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）实验动物：健康SD大鼠80只，SPF级，雌性和雄性各 40 只，体质量（238.7±11.9）g。 大鼠和饲料均购自上海宝特生命科学发展有限公司。（2）微生态制剂选用整肠生胶囊（地衣芽孢杆菌活菌胶囊，东北制药集团沈阳第一制药有限公司），为活菌制剂，每片含地衣芽孢杆菌数不低于2.5亿个，辅料为：乳糖、淀粉。

1.2 方法

1.2.1 肝硬化门脉高压大鼠模型的建立 将SD大鼠80只在自由进食、饮水的基础上腹腔注射N-亚硝基二甲胺（DMNA）12μg/kg，每周 3 次，5 周后随机选择其中6只，对大鼠肝脏进行病理切片检查，评定肝硬化程度。再随机抽取正常大鼠和造模组大鼠各4只，用戊巴比妥钠1mg/kg静脉麻醉后打开大鼠腹腔，游离门静脉主干，插管测定门静脉压力，以正常大鼠平均压力作为基础值，评定造模组是否门脉高压。如同时符合以上两点，即大鼠肝硬化门脉高压造模成功。

1.2.2 大鼠分组 选择造模成功的SD大鼠32只，随机分为模型对照组和微生态组，每组各16只，并取正常大鼠16只作为正常组。三组均给予相同饲料自由喂食，微生态组在此基础上加以整肠生活菌制剂灌胃，5mg/kg，1 次/d（人体剂量 300mg/d），连续饲喂8周。

1.2.3 指标检测与细菌培养 （1）指标检测：连续喂饲8周后，清晨空腹抽取大鼠静脉血，检验血清丙氨酸氨基转氨酶 （ALT）、天冬氨酸氨基转氨酶（AST）、总胆固醇及甘油三酯。（2）连续喂饲8周后以脱颈法处死大鼠，无菌操作采集大鼠结肠内容物，放入无菌匀浆机内碾碎，溶于粪便稀释液中10倍稀释，并置于振荡器上剧烈震荡后取稀释后标本100μL接种到各种培养基（表1），每一个稀释度重复3遍，采用平板菌落计数法，求平均值后计算每克肠道内容物所含的菌落数。

表1 各菌群培养基及培养条件

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量数据采用（±s）表示，并进行t检验。

2 结果

2.1 四种肠道微生物的变化 与正常组相比，模型对照组肠道乳酸杆菌、双歧杆菌均减少，大肠杆菌、真菌数量增加，差异均有统计学意义 （均P<0.05）；微生态组与模型对照组比较，乳酸杆菌、双歧杆菌增加，大肠杆菌、真菌数量减少，差异有统计学意义（P<0.05）。详见表2。

表2 微生态制剂对大鼠肠道四种微生物数量的影响（×104CFU/g）

2.2 对大鼠血脂及肝功能的影响 与正常组相比，模型对照组血清总胆固醇、甘油三酯、ALT及AST均升高（P<0.05），而微生态组较模型对照组总胆固醇、甘油三酯、ALT及AST均降低（P<0.05）。详表3。

表3 微生态制剂对大鼠血脂及肝功能的影响

3 讨论

3.1 肝硬化门脉高压大鼠肠道微生物改变 正常情况下，肠道中微生物的数量和种类相对稳定，以维持肠道微生态的动态平衡。同时，肠道具有一系列特有的屏障，阻止细菌易位。肝硬化门脉高压者肠道的屏障功能受损，细菌易位，引起肠道菌群的种类和/或数量的改变；同时，肝硬化者肠内神经体液调节功能异常，减少分泌肠黏膜上皮细胞间紧密连接的蛋白，使得肠道通透性增加，进一步破坏肠道屏障，加重肠道细菌易位，引发一系列炎症反应和免疫应答，进一步加重肝硬化的发生与发展[4]，严重者甚至刺激炎症因子诱发肠道感染、自发性腹膜炎、败血症等感染性并发症。本研究结果同样显示，与正常组相比，模型对照组肠道乳酸杆菌、双歧杆菌均减少，大肠杆菌、真菌数量均增加（均P<0.05），表明肝硬化门脉高压大鼠存在肠道微生物群紊乱。而微生态组与模型对照组比较，乳酸杆菌、双歧杆菌增加，大肠杆菌、真菌数量减少（均P<0.05），表明微生态制剂能增加肝硬化门静脉高压大鼠的肠道乳酸杆菌和双歧杆菌等有益菌，抑制其大肠杆菌和真菌等致病菌或条件致病菌的生长，使其肠道微生态重新回归平衡。

3.2 微生态制剂与血脂、肝功能 肝脏病变与血脂代谢紊乱密切相关。研究已经证实乳酸杆菌和双歧杆菌有降脂的作用[5]。本研究结果提示肝硬化门脉高压大鼠存在血脂代谢紊乱的现象，模型对照组的总胆固醇和甘油三酯水平均高于正常组，而微生态组这两个指标却低于模型对照组，说明微生态制剂有调脂的功效。可能机制为：（1）乳酸杆菌在肠道内定植生长过程中建立的酸性环境有利于胆固醇与胆盐发生共沉淀作用。（2）乳酸杆菌具有胆盐水解酶，可以使结合状态的胆盐水解成去结合的胆盐，与胆固醇共沉淀。（3）微生态制剂改善肠道功能后促进胆汁酸的肝肠循环，继而降低体内胆固醇的水平。（4）微生态制剂改善肠道功能后使患者排便规律，促进胆固醇随粪便排出，减少对胆固醇的重吸收。本研究结果同样提示肝硬化门脉高压大鼠存在肝功能受损，模型对照组的 ALT 及 AST 水平均高于正常组（P＜0．05），而微生态组这两个指标却低于模型对照组（P＜0．05），说明微生态制剂有改善肝功能的作用。肝脏作为清除内毒素的重要场所，细菌和内毒素移位到肝脏，会直接导致肝脏受损，并通过诱导炎症介质间接使肝脏进一步受损，而微生态制剂通过修复肠道屏障，能够恢复肠道微生态平衡，减少细菌和内毒素的移位，在一定程度上阻断了肝脏受损的路径，达到护肝作用。

3.3 创新与不足 本研究从动物实验层面研究了微生态制剂对肝硬化门脉高压的微生物、血脂和肝功能的影响，但未研究微生态制剂对大鼠肠道黏膜屏障的影响，有待于后续跟踪报道。