米诺环素对慢性脑缺血大鼠脑内Notch信号通路的影响

陈毅 尤志珺 王传玲 随晓菲 蔡志友

米诺环素作为四环素类药物中一种的有效的神经细胞保护剂，具有抗炎、抑制小胶质细胞、抑制基质金属蛋白酶表达、氧化氮类产物的产生和细胞调亡过程等作用[1-6]。有研究发现米诺环素是一种有效的脑保护剂，并能降低血管性认知功能损害的症状[2-3]。有研究证实米诺环素可以有效促进VEGF的生物活性[7]，而VEGF是脑缺血后血管新生的重要因子之一[8-10]。Notch信号通路是血管新生、内皮细胞形成的关键信号通路，激活Notch信号通路可增强内皮祖细胞的迁移、侵袭和血管形成的能力，而抑制Notch信号通路，则内皮祖细胞迁移、侵袭和血管形成的能力受到抑制。本实验通过抑制Notch信号通路及米诺环素给药后观察大鼠的学习记忆能力以及观察血管内皮生长因子VEGF和Notch信号通路下游蛋白Hes1的表达水平，以进一步探讨米诺环素是否可以通过调节Notch信号通路进而影响脑组织血管修复能力，从而发挥脑保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康成年SD大鼠40只(雄性，260～300 g，由湖北医药学院实验动物中心提供，使用许可证号 SYXK(鄂)2011-0031)，按照随机原则分为5组(n=8):假手术(Sham)组、缺血模型(Model)组、 DAPT(DAPT)组、米诺环素(Min)组、DAPT+米诺环素(DAPT+Min)组。

1.1.2 试剂及设备 盐酸米诺环素胶囊(100 mg/粒)，惠氏制药有限公司，生产批号：M33265；DAPT抑制剂 (ab120633)，Abcam公司；Anti-Hes1 antibody (ab108937)，Abcam公司；Anti-VEGF antibody (ab1316)，Abcam公司；MT-200 Morris水迷宫综合跟踪系统(由湖北医药学院基础医学研究所提供)。

1.2 方法

1.2.1 2-VO模型制备 参照文献[11-12]制作大鼠慢性脑缺血模型：手术前12 h禁食水，用3.5%的水合氯醛，按1 mL/100 g体重对大鼠进行腹腔麻醉后仰卧固定，备皮，消毒，沿颈正中线切开皮肤，分离双侧颈总动脉，行双侧颈总动脉永久结扎术，术后注意保温，常规饲养。假手术组除不结扎双侧颈总动脉外，余处理同缺血模型组大鼠。

1.2.2 给药 将米诺环素用生理盐水稀释成5 mg/mL浓度备用，DAPT溶于DMSO中并在5%葡萄糖溶液中稀释备用。假手术组、缺血模型组给予等量的生理盐水灌胃；DAPT组予以Notch抑制剂DAPT(按10 μmol/kg腹腔注射，建模成功后给药1次，以后每周给药1次，其他处理同缺血模型组)；米诺环素组以50 mg/kg米诺环素灌胃；DAPT+米诺环素组给药：在DAPT组的基础上同时给予50 mg/kg米诺环素灌胃。于建模成功正常饲养2 d后开始给药，连续给药4周。米诺环素的剂量选择参考Stirling等[13]和Yrjanheikki等[14]的有关米诺环素神经保护作用机制的研究，DAPT使用方法参考Huang Man等[15]的有关DAPT作用神经细胞的研究。

1.2.3 行为学检测 在给药饲养4周后测试大鼠在Morris水迷宫(Morris water maze, MWM)实验中逃避潜伏期的长短和跨越原平台区位置的次数。(1) 定位航行实验：水迷宫水深35 cm，水温25 ℃，在固定象限设有安全岛，高度33 cm，液面高于安全岛2 cm;共历时5 d，每组大鼠每天时间固定;大鼠入水点顺序为第1 d，E-S-W-N；第2 d，S-W-N-E；第3 d，W-N-E-S;第4 d，N-E-W-S；第5 d，E-W-N-S;记录每次找到平台的时间(即逃避潜伏期，以秒为单位计时);如大鼠在60 s内找不到平台，由实验者将其引上平台，潜伏期记为60 s，每次间隔5 min让大鼠休息，再行下次实验;(2) 空间探索实验：定位航行实验第5 d的最后1次结束时撤除平台，将大鼠从任选的非平台象限入水点面向池壁放入水中，记录大鼠第1次到达平台的时间以及2min内跨越原平台的次数和大鼠在池中的游泳路径，计算大鼠在平台象限游泳路径长度占总路径长度的百分比。

1.2.4 免疫组化实验 用3.5%水合氯醛麻醉大鼠，打开胸腔，经左心室快速灌注生理盐水，直至右心房流出液清亮为止；然后用4%多聚甲醛灌注固定，断头取脑；冠状切取视交叉后部脑组织，常规梯度酒精脱水，石蜡包埋；常规切片3～4 mm，70°烤片2 h；二甲苯脱蜡，梯度酒精洗涤， 3% H2O2室温10 min灭活内源性酶；滴加羊血清封闭液10 min；不同切片分别加入适量的羊抗大鼠Hes1、小鼠抗大鼠VEGF，37 ℃ 60 min或4 ℃冰箱过夜；加反应增强剂，37 ℃恒温孵育20 min；分别滴加辣根酶标兔抗羊IgG及兔抗小鼠IgG，37 ℃恒温孵育30 min；除加入羊血清封闭液外，以上各步间均用0.01 mol/L PBS(pH 7.4)充分洗涤；最后DAB显色，苏木素复染，盐酸酒精分化，中性树胶封片。用已知阳性切片作为阳性对照，PBS替代一抗作为阴性对照。使用Image-Pro Plus 6.0软件测定阳性细胞表达的面积，然后将假手术组定为1，换算其余各组相对值。

1.2.5 蛋白质免疫印迹法 各组脑组织加入细胞裂解液充分裂解，离心，BCA 方法行蛋白定量；取50 μg蛋白变性，经SDS/PAGE凝胶电泳，转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，分别和羊抗大鼠Hes1多克隆抗体、小鼠抗大鼠VEGF单克隆抗体作用，4 ℃过夜；洗涤后分别加入辣根过氧化物酶结合的兔抗羊IgG(1∶5000)及兔抗小鼠IgG (1∶2000)，室温孵育1 h；于超高灵敏度化学成像发光仪照相，Image Lab 3.0软件测定灰度值，与相应β-actin比较后将假手术组定为1，计算其余组相对值。所有蛋白质免疫印迹都在同组不同样品上得到重复。

2 结 果

2.1 死亡率 假手术组大鼠无死亡，缺血模型组死亡1只，DAPT组死亡2只，米诺环素组无死亡，DAPT+米诺环素组死亡1只。以上大鼠均死于术后48 h内，不列入统计，另随机选取大鼠补齐。各组大鼠死亡率比较无明显差异(P>0.05)。

2.2 行为学实验 与假手术组比较，缺血模型组的水迷宫定位航行逃避潜伏期延长(P<0.05)，第1次跨越平台时间延长(P<0.05)，跨越平台平均次数减少(P<0.05)；DAPT组与缺血模型组比较、米诺环素组与DAPT组比较、DAPT+米诺环素组分别于DAPT组和米诺环素比较，逃避潜伏期、第1次跨越平台时间及跨越平台平均次数有显著差异(P<0.05)(表1～2、图1)。

表1 水迷宫空间探索第1次跨越平台时间及跨越平台次数,n=8)

注：与Sham组比较，*P<0.05；与Model组比较，•P<0.05；与DAPT组比较，#P<0.05；与DAPT组和Min组比较，△P<0.05

图1 各组大鼠行为学检测组 A、B为各组大鼠逃避潜伏期;C为各组大鼠跨越平台时间;D为各组跨越平台次数;与假手术组比较,*P<0.05;与缺血模型组比较, ▲P<0.05;与DAPT组比较, #P<0.05;与DAPT抑制剂组和米诺环素组比较, ◆P<0.05

2.3 免疫组织化学染色法 与假手术组比较，缺血模型组Hes1和VEGF表达水平增高(P<0.05)；与缺血模型组比较，DAPT组Hes1和VEGF表达水平显著降低(P<0.05)；与缺血模型组比较，米诺环素组Hes1和VEGF表达水平增高(P<0.05)；与DAPT组比较，米诺环素组Hes1和VEGF表达水平显著增高(P<0.01)；与DAPT组比较，DAPT+米诺环素组Hes1和VEGF表达水平增高(P<0.05)(图2)。

2.4 蛋白质印迹法 与缺血模型组比较，DAPT组Hes1和VEGF灰度值下降(P<0.05)；与缺血模型组比较，米诺环素组Hes1和VEGF灰度值增高(P<0.05)；与DAPT组比较，米诺环素组Hes1和VEGF灰度值增高(P<0.01)；与DAPT组比较，DAPT+米诺环素组Hes1和VEGF灰度值增高(P<0.05)(图3)。

表2 水迷宫定位航行逃避潜伏期,s,n=8)

注：与假手术组比较，*P<0.05；与缺血模型组比较，▲P<0.05；与DAPT组比较，#P<0.05；与DAPT组和米诺环素组比较，◆P<0.05

图2 各组大鼠Hes1及VEGF免疫组化染色(海马CA1区 SP ×400倍) A为各组大鼠Hes1的表达水平;B为各组大鼠VEGF表达水平;与假手术组比较,▲P<0.05;与缺血模型组比较,•P<0.05,#P<0.05;与DAPT组比较,△P<0.01,*P<0.05

图3 各组大鼠Hes1及VEGF Western blot印迹检测 A为各组大鼠Hes1表达水平;B为各组大鼠VEGF表达水平;与缺血模型组比较, •P<0.05,#P<0.05;与DAPT组比较,△P<0.01,*P<0.05

3 讨 论

脑缺血后血管增生修复能力受损。有研究证明脑缺血后微血管的密度与脑梗死的面积相关[16]，微血管的新生为神经的再生创造了条件,这对神经功能的恢复产生了重要作用。由此可见，脑缺血后大脑微血管网的重建对受损部位的恢复是很重要的一个环节。

血管新生是指在原有血管的基础上内皮细胞增殖、迁移和重塑，进而形成新血管的过程，涉及诸多的生长因子和信号通路分子[17]，Notch信号通路就是其中比较重要的一个。众所周知，血管内皮生长因子(Vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)是血管生长因子中最重要的一员，可在体内诱导血管新生[18]。VEGF能直接刺激血管内皮细胞移动、增殖及分裂，并增加微血管通透性。VEGF与内皮细胞上的两种受体KDR和Flt-1高亲和力结合后直接刺激血管内皮细胞增殖，并诱导其迁移和形成管腔样结构；同时还可增加微血管通透性，引起血浆蛋白(主要是纤维蛋白原)外渗，并通过诱导间质产生而促进体内新生血管生成[18]。Notch信号通路是一个在进化中高度保守的细胞间信号传递通路，由Notch受体、Notch配体(DSL蛋白)和转录因子CSL(一类DNA结合蛋白)等组成,Notch蛋白是一种细胞表面跨膜受体，Notch有4个Notch同源基(Notch1-4) 和5个配体(Jagged1，2；Delta1，2，3)，Notch蛋白是一种细胞表面跨膜受体，其胞外段包含表皮生长因子样重复受体，可与配体的Delta等相互作用。配体一旦与受体结合在早老蛋白-1(Presenilin-1)/γ-分泌酶作用下Notch发生两次溶蛋白性裂解后Notch蛋白的胞内区域 (Notchintracellulardomain,NICD)，NICD作为Notch的活化形式转移进入细胞核,与DNA结合蛋白CSL(CBF-1/RBPJk-Su(H)-LAG1 )结合并使之活化，激活Hes家族，进而发挥一系列的生物学效应[19-20]。有研究证实Notch信号通路激活可增强内皮祖细胞的迁移、侵袭和血管形成的能力，促进脑外伤后神经血管的修复,而抑制Notch信号通路，内皮祖细胞迁移、侵袭和血管形成的能力受到抑制[8-10]。本实验通过DAPT抑制剂抑制Notch信号通路，VEGF的表达水平明显降低也说明了这一点。脑缺血后Notch信号通路被激活，本实验中缺血模型组的Hes1表达水平较假手术组增高证实了这一点，同时缺血模型组的VEGF表达水平较假手术组也增高，也证实了Notch信号通路的激活可提高损伤脑组织的血管修复能力。

米诺环素作为一种有效的神经细胞保护剂，具有抗炎、抑制小胶质细胞、抑制基质金属蛋白酶表达、氧化氮类产物的产生和细胞调亡过程等作用[1-6]。有研究证实米诺环素也可以有效促进VEGF的生物活性[7]。本实验中米诺环素组的VEGF的表达水平明显较缺血模型组增高，也进一步证实了米诺环素可以增强VEGF的活性。

本实验中米诺环素组中的Hes1的表达水平较DAPT组和缺血模型组增高，DAPT+米诺环素组的Hes1的表达水平较DAPT组增高，表明米诺环素可以作用于Notch信号通路中。同时米诺环素组中的VEGF的表达水平较DAPT组和缺血模型组也同步增高，DAPT+米诺环素组的VEGF的表达水平较DAPT组也增高，则说明了米诺环素可以通过Notch信号通路来调节VEGF的表达水平，这也说明米诺环素可以通过Notch信号通路来增强脑缺血后大脑的血管修复能力。

本实验证实了米诺环素可以通过Notch信号通路来提高损伤脑组织的血管修复能力，进而发挥了脑保护作用，这也为研究米诺环素发挥脑保护作用的机制向前迈进了一步，但同时也看到了本实验的一些不足之处，比如Notch有4个Notch同源基(Notch1-4)和5个配体(Jagged1/2；Delta1/2/3)，米诺环素是作用于哪一型还不清楚。另外，米诺环是否可以通过Notch信号通路来提高损伤脑组织的神经修复能力本研究没有涉及，这些问题将在今后的研究中进一步的阐释。