禽类骨髓间充质干细胞研究进展

何琳琳

(陕西理工大学 生物科学与工程学院， 维生素D生理与应用研究所， 陕西 汉中 723000)

干细胞(stem cell, SC)是来自胚胎、胎儿或成体内，具有无限自我更新和增殖能力以及不同程度分化潜能的一类细胞。根据来源分为胚胎干细胞(embryonic stem cell, ESC)、成体干细胞(adult stem cell, ASC)和诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cell, iPSC)。骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BM-MSCs)属于ASC，是一类存在于已分化组织骨髓中的未分化细胞，正常情况下处于休眠状态，在病理状态或在外因诱导下可以表现出不同程度的分化潜能和自我更新能力。BM-MSCs在骨髓中数量很少，然而在体外易于培养和扩增，可分化成为多种类型的细胞，已广泛应用于基础科学研究和临床应用研究。目前哺乳动物BM-MSCs的研究较多，如人、大鼠、小鼠、猪、山羊等[1-5]，然而禽类BM-MSCs研究相对较少。本文对禽类BM-MSCs的来源、分离纯化、表面标志物及多向分化潜能的最新研究进展作一综述。

1 禽类BM-MSCs的来源

禽类BM-MSCs的来源主要是鸡，如海兰鸡、罗曼鹤鸡、北京油鸡、Raf鸡、Hiline鸡、土耳其代尼兹利鸡、肉鸡Ross 308，包括出生后的鸡和鸡胚期的骨髓，出生后的鸡包括1～60 d的鸡，其次从鸭的骨髓中也分离到BM-MSCs。自从2009年Khatri M等[6]首次从1～14 d鸡股骨骨髓分离出BM-MSCs之后，陆续从出生后的鸡和鸭骨髓中分离获得BM-MSCs，如1～10 d海兰鸡股骨和胫骨[7]、1～14 d罗曼鹤鸡股骨和胫骨[8]、30～60 d北京油鸡胫骨[9]、2～5 d鸡股骨和胫骨[10]、3～25 d的Raf鸡和Hiline鸡[11]、15 d Raf鸡股骨和胫骨[12]、1 d鸭胫骨[13]等的骨髓。同时从鸡胚期的骨髓也可分离得到BM-MSCs，如受精后20 d的海兰褐鸡胚股骨骨髓[14]、20 d龄土耳其代尼兹利公鸡胚胫骨和股骨骨髓[15]、产前13 d鸡胚股骨骨髓[16]、来自商业用途的肉鸡Ross 308、海兰蛋鸡和SPF蛋鸡19 d龄鸡胚股骨骨髓[17]。因此，禽类BM-MSCs已从鸡胚、鸡或鸭的骨髓分离获得，其它禽类BM-MSCs目前尚无报道。

2 禽类BM-MSCs的分离纯化

BM-MSCs在组织中含量低，要获得大量活性好和分化能力高的禽类BM-MSCs，分离纯化方法至关重要。禽类BM-MSCs的分离纯化方法包括全骨髓贴壁法、密度梯度离心法、贴壁培养法。全骨髓贴壁法利用BM-MSCs贴壁生长的特性，只需将吹散的骨髓细胞悬液种植在培养皿里培养即可，而密度梯度离心法应用市售的密度梯度离心介质Ficoll-Paque或Percoll-Paque，将骨髓中的单核细胞富集后，再利用BM-MSCs贴壁生长的特性，从单核细胞中分离BM-MSCs。贴壁培养法是指将细胞贴附在一定的固相表面进行培养的方法。一般分离骨髓来源的禽类BM-MSCs采用全骨髓贴壁法，通过换液去除未贴壁的悬浮细胞，再通过传代进行纯化，目前采用这种方法已从海兰鸡[7]、罗曼鹤鸡[8]、北京油鸡[9]、土耳其代尼兹利公鸡胚[15]、未标明品种的鸡[10]和鸡胚[16]的骨髓分离得到BM-MSCs。还可采用密度梯度离心法分离，将吹打散的鸡骨髓细胞用Ficoll-Paque离心后，将单核细胞种植在培养皿[6,13,17]或者明胶包被的培养皿[14]，使其贴壁培养后分离纯化得到BM-MSCs。

3 禽类BM-MSCs的表面标志物

不同禽类来源BM-MSCs表面标志物表达与否不尽相同。来自未标明品种的鸡BM-MSCs表型是CD44、CD90、CD105阳性和CD45阴性，表达多能性标志物基因PouV、Sox2和Nanog[6]；海兰鸡BM-MSCs为干细胞标志物SSEA-3和SSEA-4阳性[7]；罗曼鹤鸡骨髓BM-MSCs表型是CD29阳性和CD34阴性[8]；北京油鸡骨髓BM-MSCs表型是CD29、CD44、CD71、CD73阳性和CD31、CD34阴性[9]；2～5 d鸡骨髓分离BM-MSCs为间充质干细胞相关标志物CD44、CD90、CD105阳性，造血细胞标志物CD45和内皮细胞标志物CD31阴性[10]；鸭BM-MSCs表达表面抗原CD44、ICAM-1和SSEA-4，不表达表面抗原CD34、CD45和SSEA-1[13]；海兰褐鸡胚骨髓BM-MSCs为CD44、CD90和CD105阳性[14]；土耳其代尼兹利公鸡鸡胚骨髓BM-MSCs表达非造血骨髓祖细胞的标志STRO-1、CD105和CD73[15]；鸡胚骨髓BM-MSCs为CD44、CD73、vimentin、CD90和CD105阳性，CD45和CD34阴性，表达多能性标志物蛋白Oct4、Sox2，表达多能性标志物基因Oct4、Sox2和Nanog[16]。可见，出生后鸡和鸭以及鸡胚BM-MSCs为间充质干细胞表面标志物，如CD44、CD90、CD105、CD29、CD71、CD73、vimentin阳性[6,8-10,13-16]，造血细胞标志物CD45、CD34、STRO-1、CD73阴性[6,8-10,13,15,16]，不表达内皮细胞标志物CD31[9]；海兰鸡和鸭BM-MSCs均表达干细胞标志物SSEA-4[7,13]，海兰鸡BM-MSCs还表达干细胞标志物SSEA-3[7]，而鸭BM-MSCs不表达干细胞标志物SSEA-1[13]；鸡BM-MSCs还表达多能性标志物基因PouV、Sox2、Nanog和Oct4[6,16]。

表1 禽类BM-MSCs的多向分化潜能

4 禽类BM-MSCs的多向分化潜能

骨髓来源的BM-MSCs具有多向分化潜能，可向骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、内皮细胞、神经细胞、雄性生殖细胞、肝细胞、胰岛细胞、心肌细胞方向分化，还可分化成为精原干细胞(spermatogonial stem cells, SSC)(如表1所示)。如鸡BM-MSCs经成骨诱导后表达基因Osteopontin，Von Kossa染色有矿化骨节形成，成脂诱导后表达基因PPARγ和aP2，油红O染色有脂滴生成，成软骨诱导后表达基因CollagenⅡ，阿尔新蓝染色有蛋白聚糖形成，表明其具有成骨、成脂、成软骨分化潜能[6]；海兰鸡BM-MSCs经成骨诱导后碱性磷酸酶染色有碱性磷酸酶阳性细胞，茜素红染色有矿化骨节形成，成脂诱导后油红O染色有脂滴生成，证明其具有成骨和成脂分化潜能，神经胶质细胞源性神经营养因子还可促使其向SSC分化[7]；罗曼鹤鸡BM-MSCs经成骨诱导后茜素红染色有矿化骨节形成，成脂诱导后油红O染色有脂滴生成，表明其具有成骨和成脂分化潜能[8]；北京油鸡BM-MSCs经成骨、成脂诱导，分别用茜素红染色、油红O染色后显示有矿化骨节形成和脂滴生成，经成内皮细胞诱导后显示典型的“鹅卵石”样形状，表达象征性的内皮细胞标志物基因和蛋白KDR和CD31，也表达造血干细胞标志物基因CD34，表明其具有成骨、成脂、成内皮细胞分化潜能[9]；Raf鸡BM-MSCs经成骨、成软骨和成脂诱导，茜素红染色、阿尔新蓝染色和油红O染色分别显示矿化骨节形成、蛋白聚糖形成和脂滴生成，表明其具有分化成为骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞的潜能[12]；鸭BM-MSCs经成骨诱导后茜素红和Von Kossa染色有矿化骨节形成，成神经细胞方向诱导后，呈现典型的神经细胞形态，表达基因Nestin、NSE和GFAP，表明其具有成骨和成神经细胞分化潜能[13]；海兰褐鸡胚股骨BM-MSCs在体外经维甲酸和鸡睾丸提取物诱导可分化成为雄性生殖细胞[14]；土耳其代尼兹利公鸡胚BM-MSCs经成骨、成脂、成软骨诱导，分别用茜素红、油红O、阿尔新蓝染色后显示有矿化骨节形成、脂滴生成和蛋白聚糖形成，表明其具有成骨、成脂、成软骨分化潜能[15]；鸡胚BM-MSCs经成骨、成脂、成肝细胞、成胰岛细胞诱导，分别用Von Kossa、油红O、希氏高碘酸染色、DTZ染色、阿尔新蓝染色后显示有矿化骨节形成、脂滴生成、有糖原储存、有β细胞产生，经神经细胞诱导有神经元特异性标记物β-3微管蛋白表达，经心肌细胞诱导有心脏特异性标志物蛋白如细胞骨架标记Troponin I和核标记物GATA4表达，表明其具有成骨、成脂、成肝细胞、成胰岛细胞、成神经细胞、成心肌细胞方向的分化潜能[16]；罗斯308肉鸡、海兰蛋鸡和无特定病原体(specefic pathogen free, SPF)蛋鸡BM-MSCs经成骨诱导后茜素红染色有矿化骨节形成，表明其具有成骨分化潜能[17]。可见禽类BM-MSCs多向分化潜能中检测最多的是其成骨细胞分化潜能，其次是成脂肪细胞和成软骨细胞分化潜能，其他方向的分化潜能检测较少。

5 总结和展望

目前已从不同禽类如海兰鸡、罗曼鹤鸡、北京油鸡、Raf鸡、Hiline鸡、土耳其代尼兹利鸡、肉鸡Ross 308和鸭的骨髓分离得到BM-MSCs，今后还可以进一步扩大禽类BM-MSCs的禽类来源，如汉中地理标志产品略阳乌鸡以及我国知名的一些禽类。目前，禽类BM-MSCs分离纯化方法相对较少，它包括全骨髓贴壁法、密度梯度离心法、贴壁培养法，这些方法可单独使用，也可组合使用。除了采用上述3种方法之外，哺乳动物BM-MSCs的分离纯化还采用免疫磁珠法[18]和流式细胞仪荧光激活细胞分选(fluorescence-activated cell sorting, FACS)技术[19]，两种方法都是基于已明确的表面标志物表达与否进行分离纯化。然而，由于禽类BM-MSCs表面标志物没有统一的标准或规定，目前没有明确的纯化用表面标志物，因此其分离纯化还未涉及上述两种方法。不同禽类来源的BM-MSCs表面标志物表达与否不尽相同。禽类BM-MSCs具有多向分化潜能，可向骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、内皮细胞、神经细胞、雄性生殖细胞、肝细胞、胰岛细胞、心肌细胞方向进行分化，还可分化为SSC。目前禽类BM-MSCs的横向分化是当前研究的热点，随着研究的不断开展，将会发现更多禽类来源BM-MSCs的分化潜能。但是由于BM-MSCs禽类品种、年龄、胚胎期、分离方法等的不同，分离获得的BM-MSCs在表面标志物和分化潜能方面存在差异，新的禽类BM-MSCs表面标记物标准亟待建立。相信随着禽类BM-MSCs来源的扩展，分离方法、生物学特征和分化潜能研究的不断深入，必将为禽类发育生物学及其用于再生医学的研究带来新的前景和希望。

[责任编辑：李 莉]