人骨形成因子7基因慢病毒载体的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

屈彦纯 王爱香 郭嘉宁 王嘉南 杨 阔 朱小泉 杨 泽

作者单位： 1.天津医科大学第二医院，天津市泌尿外科研究所 3002112.北京医院，国家老年医学中心，卫生部老年医学重点实验室 100730

BMP7是TGF-β超家族的一员。研究发现BMP7在多种生理功能和相关老年疾病发生发展中具有重要的作用，尤其在糖尿病肾脏损伤保护中是一个关键因素。通过重组BMP7的人工表达，可以有效逆转高糖肾脏损伤，并促使恢复正常的肾脏功能。研究发现骨髓间充质干细胞(MSCs)是体内分泌BMP7的功能细胞，近年来糖尿病肾病干细胞治疗已取得了长足进展。将干细胞治疗与重组BMP7高表达结合起来，必将对糖尿病肾病的治疗创新发展产生推动作用。本研究致力于建立一种高表达人BMP7的MSCs细胞系，从而为开发新的治疗途径奠定基础。

1.材料和方法

1.1 材料和试剂 大肠杆菌感受态细胞DH5α和293 T细胞系由研究所中心实验室提供;pCDH慢病毒载体及包装质粒由卫生部老年医学重点实验室朱小泉博士提供，BMP7外源基因天津科技大学生物工程学院刁爱坡教授惠赠;Trizol，RT试剂盒，PCR Mix DNA连接酶购自Takara公司；BamH I，EcoR I，来源于Fermentas公司;慢病毒浓缩试剂盒由Biomiga公司提供;胎牛血清、低糖DMEM、胰酶由Gibco公司提供;一抗来自武汉博士德公司，二抗由北京中杉金桥提供，转染及其他分子生物学试剂购于Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 骨髓间充质干细胞的培养：采用全骨髓培养法，取6周小鼠的股骨和胫骨等长骨，直接用含10%的FBS培养基冲洗，获得的骨髓细胞不用离心直接接种在培养瓶里，24～48小时除去悬浮细胞，48～72小时第一次更换培养基。接下来3～5天更新培养基，直至第一次传代。一般8～10天以后首次传代。细胞爬片免疫组织化学染色检测CD44，CD105等干细胞相关标记物。

1.2.2 pCDH-BMP7慢病毒载体的构建与鉴定：PCR扩增BPMP7全长基因，根据Genbank 中BMP7(NM_001719)的mRNA序列为模板，设计特异引物并分别其5’端添加EcoR I和BamH I酶切位点及保护碱基。引物序列如下：Forward 5‘ CCTAAGCTT-ATG CAC GTG CGC TCA CTG CGA GCT’，Reverse 5‘TTT GGA TC-C CTA GTG GCA GCC ACA GGC CCG GAC CA。PCR条件：94℃ 5分钟，(94℃ 1分钟，65℃ 1分钟，72℃ 1分钟)×35个循环，72℃ 7分钟，检测产物大小为1314bp。RT-PCR 产物以EcoR I和BamH I双酶切。回收的目的片段与pCDH慢病毒骨架载体连接过夜。次日连接产物转入感受态DH5a,小量抽提质粒，送苏州金唯智生物技术公司测序。

1.2.3 慢病毒的包装与滴度测定：转染前1天，将293T 105个细胞接种于15cm2培养皿中，37℃ 5% CO2过夜培养。取1.5ml Opti-MEM培养基，加入100μl的含有穿梭质粒和包装质粒的(pCDH-BMP7:PPA2X2:EMG=5:3:2)慢病毒;另取1.5ml Opti-MEM，加入300μl Lip2000;将上述两种液体充分混匀，室温静置20分钟。然后转染培养皿中的细胞，8小时后除去转染液加入新鲜培养液。72小时收集上清，利用Biomiga公司EZgeneTM试剂盒按照标准流程浓缩病毒，-80℃冰箱保存。将293 T细胞以1×104浓度接种于24孔板，37℃ 5% CO2培养24小时后各孔加入不同浓度梯度的病毒液100μl(10-1、10-2、10-3、10-5)以pCDH-GFP病毒感染293T细胞染细胞作为对照组。72小时后通过荧光显微镜观察，计算荧光细胞数，并根据公式TU/μl =(GFP阳性细胞率×转染细胞数/100×每孔加入病毒稀释液体积)×1/稀释因子计算出病毒液滴度。

1.2.4 慢病毒感染MSCs：感染前1 天，将处于指数生长期的MSCs以5×104接种于12孔板中，将待转染细胞分组:A 组:pCDH-BMP7 转染组;B组:空质粒转染组。次日，将病毒以180倍的感染复数(MOI=180)感染细胞，并加入终浓度5μg/ml的Polybrene增加转染率(B组以同样方法转染空质粒pCDH-GFP)。24小时更换培养基，48～72小时观察转染细胞荧光表达情况。通过嘌呤霉素(2μg/ml)筛选得到稳定扩大培养后进行基因表达检测。

1.2.5 定量RT-PCR检测BMP7 mRNA 表达：以TRIzol RNA提取试剂盒提取经转染后48小时的MSCs总RNA进行RT-PCR反应，上游引物为5’-TTCCTCACCGACGCCGACAT-3’ 下游引物为5’-ATCACAGCCACCAGCAACCACT-3’琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物(若有hBMP7mRNA的表达则应出现328bp DNA片段)。

1.2.6 Western blot 检测感染后BMP7蛋白的表达：取病毒感染1周后的MSCs，提取总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。取20μl 蛋白上样通过丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后将蛋白转到PVDF膜上，以5% 脱脂奶粉封闭2小时，一抗(稀释至1:500)4℃孵育过夜，加入二抗(稀释至1:3000)室温孵育1小时后ECL曝光显色，条带灰度值通过BAND LEADER 3.0软件定量，重复三次取平均值。

2.结果

2.1 pCDH-BMP7慢病毒表达载体的构建与鉴定 构建的pCDH-BMP7表达载体经EcoR I和BamH I双酶切后可获得1302bp的BMP7基因蛋白编码序列的扩增片段，经金唯智公司序列测定未发现基因移码或点突变，可用于进一步的病毒包装和细胞感染表达工作(图1)。

2.2 慢病毒包装与滴度测定 慢病毒3种质粒共同转染293 T细胞后，48～72小时后观察细胞荧光表达。构建的质粒能够成功感染293 T细胞。根据计算公式计算出浓缩后pCDH-BMP7慢病毒病毒液滴度为5×108TU/ml，空质粒pCDH-GFP的滴度为3×108TU/ml，能满足外源基因表达对病毒滴度的要求。

2.3 慢病毒感染MSCs

2.3.1 骨髓间充质干细胞的培养与鉴定：经淋巴细胞分离液密度梯度离心得到比较一致的球形细胞。原代培养24小时后细胞贴壁，其后细胞开始分裂增殖，形成细胞团。9～12天时细胞达95%以上。多次传代的MSCs接近融合生长时，有更均匀有序的成纤维细胞样分布特征(图2a)。连续传4代，细胞形态基本稳定。免疫组织化学染色检测表明小鼠骨髓MSCs表达CD44和CD105等表面标志，基本不表达造血细胞表面标志CD34，符合MSCs特征(图2b)。

2.3.2 慢病毒感染MSCs：病毒以180倍感染复数(MOI=180)感染小鼠MSCs，24小时更换培养基后细胞荧光基本不表达，感染72小时后荧光显微镜下可以观察到明亮的绿色荧光，MSCs细胞感染率达到75%以上(见图2c)。

2.4 定量PCR检测BMP7基因mRNA的表达 收获病毒感染72小时后的MSCs，提取总RNA,反转录获得cDNA通过特异引物扩增328bp的特异片段，发现感染病毒的MSCs BMP7表达显著升高，表明外源基因BMP7获得了稳定的高表达(图3)。

注：a. pCDH-BMP7双酶切目的基因片段电泳图。左泳道为目的片段，右泳道为分子量参照。b. pCDH-BMP7扩增引物附近序列测定图谱，与基因库序列一致。图1

注：a.骨髓间充质干细胞形态特征(200X)；b.CD44免疫组化染色阳性(100X);c.病毒转染72小时后GFP荧光表达情况(100X)。图2

注：a.RT-PCR电泳图左侧起泳道1～2为BMP7基因转染组，3～4为空质粒转染组，最右侧为分子量参照物；b.实时定量PCRΔCt值在基因转染组与对照组之间进行比较差异极显著。图3

2.5 Western blot检测BMP7蛋白的表达 提取病毒感染后的各组MSCs 的总蛋白，进行Western 杂交检测，结果显示(见图4 ):pCDH-BMP7转染组高表达BMP7 蛋白，而pCDH-GFP 空质粒转染组、仅检测到内源本底BMP7蛋白表达(见表1)。这说明包装病毒液感染间充质细胞后，能够稳定过表达外源BMP7蛋白。

注：左侧为BMP7基因转染组BMP7表达显著升高。图4 Western杂交结果

VariablesControl(m±s.d)Overexpressed(m±s.d)t-valueSig.(p)Mean.d95%CIDensity91.74±7.23195.91±2.8817.96.000104.1891.71～116.65Ratio2.98±0.156.66±0.2319.98.0003.683.24～4.12

3.讨论

3.1 骨形态发生蛋白-7的结构和功能 BMP-7属于TGF-β的超家族，其编码基因cDNA全长l 293 bp，它包含一个开放阅读框(oRF)，编码产生的前体蛋白由431个氨基酸构成，分为信号肽段、前体肽段和成熟肽段三个部分。作为BMP家族的一员 BMP-7不仅与骨组织发生、发育、再生和修复密切相关，而且BMP7在多种生理功能和相关老年疾病发生发展中具有重要的作用，尤其在糖尿病肾脏损伤保护中是一个关键因素。通过重组BMP7的人工表达，可以有效逆转高糖肾脏损伤，并促使其恢复正常的肾脏功能。近年来BMP7已经成为重要的基因靶点，在糖尿病肾病等疾病的治疗康复中具有重要意义。

3.2 外源性人BMP-7在MSCs中的表达 骨髓MSCs 在体内外增殖能力很强，且具有多分化潜能，是一种理想的基因工程载体细胞，且在体内负责分泌天然的BMP7生长因子，目前MSCs治疗快速发展，已日益被人们接受。以骨髓MSCs作为外源BMP7表达宿主，既有利于外源基因在体内的快速增殖，又能保证外源表达蛋白的天然活性。实验构建了人BMP7的慢病毒表达载体，并通过慢病毒介导将人BMP-7基因转入小鼠骨髓MSCs中。BMP7 mRNA的表达是细胞表达BMP7多肽蛋白的前提，同时也证明了BMP7基因在MSCs基因组的有效整合。本实验通过实时定量RT-PCR和Western blot证实重组基因慢病毒感染细胞后能够表达外源性BMP7的mRNA和蛋白，从而证实采用此方法进行BMP-7体外表达是有效的。

3.3 慢病毒载体基因表达的特点 将外源DNA 导入真核细胞的方法有瞬时转染与稳定转染两种。瞬时转染中，外源DNA无需整合到宿主染色体，目的基因会随着细胞的分裂逐渐丢失;稳定转染是将目的基因整合到宿主染色体DNA中，从而建立含有外源基因的细胞系克隆。研究携带外源基因的MSCs移植对糖尿病肾病的疗效需要BMP7基因在MSCs中长期稳定的表达。慢病毒载体来源于改造的人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)， 是一种稳定转染的理想载体，其能够感染分裂或非分裂细胞，目的基因片段容量大，表达时间长，且不易引起免疫反应。因此，将长为1293 bp 的BMP7基因稳定转入MSCs，并建立稳定转染的细胞系，慢病毒载体是一个非常有力的工具。