食品抗氧化剂叔丁基对苯二酚与溶菌酶结合特性的荧光光谱学研究

吴 笛， 梅 森， 胡 霞， 包苗苗， 康馨樾， 王 卫

(1.成都大学 肉类加工四川省重点实验室， 四川 成都 610106； 2.成都大学 药学与生物工程学院， 四川 成都 610106)

0 引 言

目前，酚类抗氧化剂作为食品添加剂被广泛用于食品的生产加工过程中，以抵抗因氧化引起的脂肪酸败、颜色改变等食品腐坏[1].叔丁基对苯二酚(Tert-butylhydroquinone，TBHQ)是一种脂溶性酚类食品抗氧化剂，常被用来保护食品的油脂和脂肪，其能有效地抑制猪油、家禽脂肪的氧化变质[2].但现有的TBHQ作为食品防腐用化学制品的应用条例的相关规定并不严格.有研究表明，TBHQ会伤害生物体自身的防御机制，且该酚类食品抗氧化剂在其代谢途径中还可能存在潜在的致突变、致癌性等情况[3-5].溶菌酶(Lysozyme，LYZ)是一类具有抗菌作用的蛋白酶，它是一个单一的、由129个氨基酸残基折叠并带有2个域的非糖基化多肽链，且其中含6个色氨酸和3个酪氨酸[6-7].这种蛋白质天然丰度高，作为生物体内的酶具有独特的可以破坏细菌细胞壁的能力，从而防止细菌感染[8].当多样的内生和外生有机小分子进入人体，配体与LYZ的结合容易被观察到[9].因此，本研究将LYZ选作与TBHQ在人体内相互作用的研究对象，在分子水平上探究苯酚类抗氧化剂与抗菌功能性蛋白质间的相互作用机理，以探讨有潜在毒性的食品添加剂在人体内可能的传递途径.

1 材料与仪器

1.1 材 料

实验所用材料包括：TBHQ(批号，209429，纯度>99%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；LYZ(批号，A610308，纯度>98%)，上海生工生物工程股份有限公司；无水乙醇(批号，2017092102)，成都市科龙化工试剂厂；磷酸盐(PBS)缓冲液干粉(批号，P1022)，北京索莱宝科技有限公司；华法林(批号，419960，纯度≥98%)、布洛芬(批号，408218，纯度≥98%)，购自北京百灵威科技有限公司；三蒸水，实验室自制.

1.2 仪 器

实验所用仪器包括：CARY Eclipse型荧光光谱仪(美国VARIAN公司)；Horiba Jobin Yvon FluoroLog-TCSPC型荧光光度计(法国HORIBA科学仪器公司)；pHS-3C型精密pH计(雷磁—上海精科有限公司)；BS-224S型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；XW-80A型旋涡混合器(上海青浦沪西仪器厂)；HH-S6型恒温水浴锅(郑州长城科工贸有限公司).

1.3 方 法

1.3.1 样品制备.

TBHQ溶解在无水乙醇中，储备液浓度为2.0×10-3mol/L；LYZ储备液(1.0×10-4mol/L)由0.05 mol/LPBS缓冲溶液配制(含0.1 mol/L氯化钠调节样品溶液离子强度).

在预实验阶段，首先对PBS缓冲溶液的pH值的选择进行了测试，即向处于生理酸碱性条件(pH 7.4)和处于LYZ最适pH条件(pH 6.5)的LYZ溶液中分别加入0×10-6、1.0×10-6、1.5×10-6、2.0×10-6、3.0×10-6、5.0×10-6、1.0×10-5mol/L的TBHQ溶液，发现pH值为6.5时，该状态更适合LYZ稳定地与有机小分子反应，故本实验中PBS缓冲液的pH值均为6.5.在实验中，LYZ的浓度由其溶液在波长280 nm处的摩尔消光系数值37 750 mol-1·cm-1校正确定[10].同时，所有溶液均在使用时稀释至所需浓度，并在4 ℃条件下避光保存.

1.3.2 荧光滴定.

荧光强度测定时，在2.0×10-6mol/L的LYZ溶液中分别滴加0×10-6、1.0×10-6、2×10-6、4.0×10-6、6.0×10-6、8.0×10-6、1.0×10-5、1.2×10-5mol/L的TBHQ溶液.用PBS缓冲溶液定容，涡旋混匀，分别在25 ℃、31 ℃及37 ℃条件下反应1 h.测定所用石英比色池光程为1.0 cm，激发波长为295 nm，激发狭缝为5 nm，发射狭缝为10 nm，测量范围为300～500 nm.

同时，所有荧光强度的测量都按照文献[11]中的相关方法进行内滤效应的校正.

1.3.3 同步荧光.

在与荧光滴定实验相同条件下，激发波长范围设置为200～400 nm，激发波长与发射波长的差值(Δλ)分别为15 nm和60 nm，分别对应酪氨酸和色氨酸微环境特征，狭缝宽度设置与荧光强度实验相同.

1.3.4 三维荧光.

室温下，扫描TBHQ存在与否时的LYZ的三维荧光谱图，LYZ的浓度为2.0×10-6mol/L，混合体系样品由LYZ和TBHQ以摩尔比1∶10组成.测定时，激发波长的变化范围为200～400 nm，变化间隔为5 nm，发射波长收集范围为200～500 nm.

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1.3.5 荧光寿命.

荧光寿命的测试在FluoroMax-4模块式荧光光谱仪完成.室温下设定，激发波长为280 nm，发射波长为345 nm.测试样品共计3个样：在2.0×10-6mol/L的LYZ溶液中分别滴加0×10-6、4.0×10-6、1.2×10-5mol/L的TBHQ溶液.

1.3.6 数据分析.

在荧光滴定实验中，所有的结果均为3次独立重复性实验得到.最大的实验测量误差保持在5%以内.数据在经过方差分析后由OriginPro软件处理，其中，荧光寿命的数据处理采用迭代拟合方法，并以χ2值及残差值进行评估.

2 结果与分析

2.1 TBHQ和LYZ相互作用机理分析

2.1.1 荧光猝灭分析.

荧光测量能够提供小分子物质对蛋白质的结合信息[12].LYZ是一个具有多色氨酸(Tryptophan，Trp)残基的蛋白质，其单晶结构显示，每一个LYZ分子有6个色氨酸.色氨酸具有显著的荧光强度和对周围微环境敏感的特性，可作为LYZ内源性荧光探针.当LYZ和其他化合物作用时，它的内源性荧光(主要由编号为Trp62，Trp63和Trp108的氨基酸贡献)会随配体的浓度改变而变化，从而提供配体导致LYZ荧光现象变化的信息[13].在配体小分子和LYZ发生作用时，LYZ分子可能发生构象转变，与基质相结合、离解或变性等情况，这将导致其本身的荧光强度降低而发生荧光猝灭.测试温度为25 ℃时，1～7号样品中，LYZ浓度保持恒定，TBHQ浓度等梯度增加，TBHQ对LYZ的荧光猝灭图谱如图1所示.

图1 TBHQ对LYZ的荧光猝灭图谱(25 ℃)

由图1可见，体系中加入TBHQ后，LYZ内源荧光强度明显降低，且随着TBHQ浓度增加，猝灭效果增强.结果表明，当LYZ与TBHQ共存于一个体系中时，两者之间会发生某种作用，从而导致LYZ内源荧光强度的降低，而该荧光猝灭机制与温度密切相关.对此，本实验采用Stern-Volmer方程[14]来分析不同温度下(25 ℃、31 ℃及37 ℃)的荧光猝灭类型.

(1)

式中F0和F分别为加入TBHQ前后LYZ的荧光强度；[Q]为TBHQ浓度；KSV由F0/F对[Q]线性回归作图得到，为Stern-Volmer方程的猝灭常数.

由恒温梯度所得数据，经Stern-Volmer方程拟合，得到3个温度下猝灭常数KSV分别为，1.982×104L/mol(25 ℃，R2=0.9877)、1.925×104L/mol(31 ℃，R2=0.9900)和1.894×104L/mol(37 ℃，R2=0.9880).拟合数据显示，猝灭常数随温度升高而略减小，根据荧光猝灭理论[12]，TBHQ可能与LYZ结合形成了体系复合物，发生了静态猝灭.

2.1.2 荧光寿命分析.

由“2.1.1”项中Stern-Volmer方程拟合结果可知，随着温度的增加，猝灭常数KSV逐渐减小，但这种趋势并不太明显.为进一步阐明该体系的荧光猝灭机理，本研究检测得到了荧光体的荧光寿命τ值的变化，结果如图2所示.

图2不同浓度TBHQ对应的LYZ的荧光衰减曲线

由于基态复合物的形成不会改变未结合荧光体的荧光衰减时间，因此，荧光体的荧光寿命会保持不变.猝灭剂与荧光体在饱和情况下，检测的是复合体的荧光寿命，此时相对于空白荧光体的荧光寿命，复合体可能出现轻微寿命减弱的情况.动态猝灭是作用在整个激发态的过程，这会导致整个荧光体激发态的衰减加快，荧光体荧光寿命减小.该体系荧光寿命通常用平均荧光寿命[15]表示，

τ=τ1α1+τ2α2+τ3α3

(2)

式中，τ为平均荧光寿命；τi和αi分别是i次拟合对应的延迟时间和相对强度.

计算得到LYZ-TBHQ体系不同浓度下的荧光寿命如表1所示.

表1 不同TBHQ浓度对应的LYZ荧光寿命

表1数据显示，随着体系中TBHQ浓度的增加，LYZ荧光寿命出现轻微降低，降幅小于1%.据此可以判定，TBHQ对LYZ内源荧光的猝灭遵循静态猝灭机理，TBHQ通过与LYZ结合形成了复合物.

2.2 TBHQ对LYZ的结合特性分析

2.2.1 结合强度.

当TBHQ对LYZ的猝灭过程为静态猝灭时，假定小分子配体TBHQ在LYZ上有n个相同且独立的结合位点，那么荧光强度、猝灭剂的浓度与结合常数及结合位点数之间的关系符合双对数方程，即修正的Stern-Volmer方程，也称为双对数曲线[12]，

log(F0-F)/F=logKa+nlog[Q]

(3)

式中，Ka(截距)为TBHQ与LYZ的结合常数；n(斜率)表示结合位点数.

不同温度下，TBHQ与LYZ相互作用的计算结果如表2所示.

表2 不同温度下TBHQ和LYZ相互作用体系中的结合常数、结合位点数及热力学参数

表2数据表明，TBHQ能与LYZ形成较强的结合，结合常数随温度的升高而降低.TBHQ与LYZ的结合位点数大约为1，随测试温度的改变，结合位点数无明显变化.

2.2.2 热力学参数和结合力类型的确定.

通常情况下，有机小分子与蛋白质间的相互作用力可能包括静电作用力、氢键作用、范德华力和疏水作用，具体可由热力学参数如焓变、吉布斯自由能变化和熵变的正负性和大小进行判断.由Van't Hoff方程和Gibbs-Helmholtz 方程，可根据不同温度下结合常数的变化计算得到TBHQ与LYZ的相互作用热力学参数为，

(4)

ΔG=ΔH-TΔS

(5)

式中，T为实验温度，Ka为相应温度下的结合常数，R为摩尔气体常数，ΔH为相互作用体系焓变，ΔS为体系熵变，ΔG为体系的吉布斯函数.

有研究认为，当ΔH<0或ΔH≈0而ΔS>0时，主要作用力为静电作用力；当ΔH<0且ΔS<0时，主要作用力为范德华力或氢键作用；当ΔH>0且ΔS>0时，主要作用力为疏水性作用[16].表2数据显示，ΔG为负值，表明TBHQ和LYZ的结合是一个自发的过程，且ΔH和ΔS在此温度范围内保持负值，说明TBHQ与LYZ的主要相互作用力为氢键作用和范德华力.

2.3 TBHQ对LYZ构象及氨基酸残基微环境的影响

利用同步荧光法的优势在于该法可以将普通荧光光谱内源性荧光生色团的重叠发射峰区分开来.Δλ=15 nm 时，表现Tyr的特征同步荧光峰；Δλ=60 nm时，则会表现Trp的特征同步荧光峰[16].为了阐明LYZ-TBHQ体系中，荧光生色团中的酪氨酸和色氨酸残基到底发生了怎样的变化，本研究进行了同步荧光实验，Δλ固定在15 nm和60 nm时对应的同步荧光谱图如图3所示.

图3 TBHQ-LYZ体系同步荧光光谱及三维荧光曲面等高线图

图3显示，随着TBHQ的浓度增加，LYZ荧光强度降低，说明TBHQ同时猝灭了色氨酸与酪氨酸残基发射的荧光.Δλ固定为60 nm时,可以看到荧光强度降低且伴随着峰位蓝移，暗示着色氨酸残基所处微环境极性减小或疏水性增加.而Δλ固定为15 nm时，峰位未发生明显移动.同步荧光结果证明TBHQ在LYZ上的结合位置应当更靠近色氨酸残基.

而在LYZ的三维荧光曲面图中，激发波长225 nm处(左)波形由色氨酸和酪氨酸残基发射荧光引起，约280 nm处(右)的峰则为为多肽骨架出峰[17].图3(C)、(D)分别为LYZ和LYZ-TBHQ体系的三维荧光.据该谱图显示，因TBHQ的加入，色氨酸与酪氨酸残基峰的强度明显降低，而多肽骨架峰则出现了轻微的增强.表明该体系中，TBHQ与LYZ的结合对LYZ中色氨酸和酪氨酸残基影响相对较显著，而对LYZ多肽骨架仅显示了轻微的干扰，LYZ的整体构象仍保持完整.

3 结 论

本研究表明，荧光光谱法是探讨食品抗氧化剂TBHQ与LYZ结合特性的一种有效方法.研究结果显示，酚类食品抗氧化剂TBHQ能与LYZ形成不发光的基态复合物，结合常数数量级处于在104的中等级别，氢键作用和范德华力主导这一自发结合过程，且该结合过程会导致LYZ的氨基酸残基微环境发生改变，且LYZ的整体构象仍保持完整，但其具体结合位置尚需进一步研究.本研究结果有助于在分子水平上理解酚类食品抗氧化剂进入生物体后，LYZ对其的携带和转运过程.