香菇原生质体杂交后代的遗传分析

刘 娜， 张 敏， 宋 莹， 刘俊杰

(辽宁省农业科学院食用菌研究所，辽宁沈阳 110161

香菇(Lentinulaedodes)营养丰富，具有较高的保健价值，自古以来深受人们的喜爱[1]。中国是人工栽培香菇的发源地和世界香菇第一生产大国，目前，我国香菇年产量约为10万t，占世界总产量的90%以上。香菇品质的好坏与品种有很大关系，所以优良香菇品种的选育尤为重要。

原生质体杂交育种技术中的单核原生质体是由双核菌丝体中直接分离得来的，没有经过有性阶段，一般认为能更好地保持亲本的性状。利用这种原生质体再生单核体，更容易定向选育优良菌株[2]。同工酶分析作为分子遗传标记技术之一，不仅被广泛应用于动植物的遗传分析、生理生化研究，而且被作为化学分类的重要指标应用于真菌的分类鉴定中，特别是在属内种间及品种之间的分类鉴定中是非常有效的[3-4]。

在食用菌杂交育种中，亲本的合理选配及杂种的准确鉴定是至关重要的环节。多年来，育种工作者常常根据育种材料的生态型、生理特性及地理距离的差异选配亲本。但是，这类差异与亲本固有的遗传差异往往并不完全一致。

本研究中的亲本是基于酯酶同工酶技术、简单重复序列区间(inter-simple sequence repeat，简称ISSR)分子标记技术，结合农艺性状选择的4个菌株(168、931、荷香1号和野生香菇)，制备原生质体并单单杂交，采用酯酶同工酶技术对原生质体单核化对称杂交获得的后代及其亲本进行遗传分析，旨在鉴定杂交后代与亲本的遗传关系及杂交子的真实性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌种及来源详见表1。

表1 供试香菇菌株及其来源

PDA综合培养基配方：200 g马铃薯，20 g葡萄糖，20 g琼脂，3 g磷酸二氢钾，1.5 g硫酸镁，3 g蛋白胨，1 000 mL水，pH值自然。

1.2 试验方法

1.2.1 杂交菌株获得 获得单核原生质体杂交菌株的试验参照甘炳成等的方法[5]。

1.2.2 菌丝培养 将杂交亲本及杂交后代菌株接于 25 mm×25 mm的试管内，每个菌株接10支，置于23 ℃恒温培养15 d，刮取菌丝。

1.2.3 酯酶同工酶方法 采用垂直平板聚丙烯酰胺电泳法，收集供试菌株菌丝0.5 g/份，用液氮研磨，将样品收集于 1.5 mL 离心管中，加入0.5 mL样品提取液。将研磨后的样品在4 ℃、12 000 r/min条件下离心20 min，取其上清液。将上清液、蔗糖溶液按体积比1 ∶1混合后作为电泳样品。点样量为40 μL，以溴酚兰作为电泳指示剂，在4 ℃条件下电泳，初期电压为每板150 V，当溴酚兰指示剂进入分离胶后电压升为每板250 V，待指示剂迁移至距末端1 cm左右处停止电泳，染色，保存备用。

1.3 数据分析

聚类分析。相对迁移率(Rf)=X/Y。式中：X为从点样孔下沿开始，酶带在凝胶中的迁移距离；Y为从点样孔下沿开始，指示剂在凝胶中的迁移距离。在测量迁移距离时，以酶带的中部位置为准。依据酯酶酶谱，按照条带的有无进行标记，在相同迁移率位置上，有条带的记为1，无条带的记为0。利用DPS数据处理软件，分析得到供试菌株的聚类分析图。

2 结果与分析

2.1 杂交亲本与杂交后代酯酶同工酶图谱

对酯酶同工酶图谱经过软件Gel-Pro analyzer进行条带识别和人工审核的结果如下：由图1-A、表2可知，亲本59、xy2及其杂交后代共有迁移率各异的条带13条。杂交后代ln3、ln4、ln8与亲本有1条共同条带，Rf为0.595，杂交后代有3条特异性条带，Rf分别为0.351、0.402、0.571，说明杂交后代与亲本之间有共源性，但杂交后代中又有属于自己的特征酶带，是有别于亲本的新菌株。

表2 以59和xy2为亲本的酯酶同工酶的相对迁移率

注：“—”表示没有酶带。下表同。

由图1-B、表3可知，供试菌株亲本ztd、59及其杂交后代的酯酶同工酶图谱表现不同，酯酶同工酶酶谱带数为5～10条，所有酶带的Rf为0.171～0.804，6个菌株所共有的Rf为0.595、0.763，可以认为是香菇的基础酶谱带，表明6个香菇品种之间有同源性，在主要代谢过程中具有相似的生理性状。4个杂交后代在Rf为0.253、0.282、0.361、0.386、0.430、0.481、0.557、0.598、0.620、0.804的位置与亲本存在差异，表明杂交后代虽然与亲本菌株间有相同的酶带，但是又有各自的特征酶带，为新菌株。其中杂交后代中ln15与其他杂交后代遗传距离较远，具有多条特征性条带，说明ln15的变异幅度较大。

由图1-C、表4可以看出，亲本ztd、80与其杂交后代酶谱带数和酶活性有较明显的差异，其中共同的酶带有2条，Rf分别为0.408、0.578。2个亲本酶带类型、数量、位置及宽度相差明显，说明二者亲缘关系较远，为远源杂交[6]；杂交后代酶带类型、数量、位置及宽度相差较小，说明其亲缘关系较近。Rf为0.170的是杂交后代共有而亲本不具备的酶带，可以看出，杂交后代有别于亲本。

由图1-D、表5可以看出，以ztd、xy2为亲本，每个杂交后代与亲本菌株有6～9条不等的酶带。对供试菌株的迁移率分析表明，迁移率都在0.092～0.738之间。供试菌株在Rf为0.571、0.613这2处均有酶带出现，为杂交亲本与后代共有的酯酶酶带。杂交后代拥有的3条酯酶酶带中，Rf为0.399、0.417的酶带与亲本ztd共有，Rf为0.595的酶带与亲本xy2共有，而Rf为0.455的酶带为杂交后代区别于亲本所特有的酶带。

表3 以59和ztd为亲本的酯酶同工酶相对迁移率

2.2 聚类分析图

从图2可以看出，931(59)和野生香菇(xy2)2个菌株遗传距离较远。在相异系数为0.68时分为2类，第1类为ln3、ln4、ln8，第2类为59、xy2；杂交后代遗传相异系数较小，在相异系数为0.51时聚为一类，但与2个亲本的遗传相异系数较大，在相异系数为0.85时聚为一类。由此可以看出，杂交后代是有别于2个亲本的新菌株。

从图3可以看出，以931(59)、168(ztd)为亲本进行杂交，931(59)和168(ztd)的亲缘关系较远，在相异系数为0.78时分为3类：第1类为ln15，第2类为ztd、ln1、ln7、ln10，第3类为59；杂交后代中ln15与其他菌株的亲缘关系较远，其他几个杂交后代亲缘关系较近，在相异系数为0.73时杂交后代与亲本ztd聚为一类，可以初步判断，杂交后代遗传性状与ztd较为接近。在后期试验中发现，ln1、ln7、ln10在生育期、菇体形态方面都接近亲本ztd。

从以荷香1号(80)、168(ztd)为亲本杂交后代的聚类分析结果可以看出，在遗传相异系数为0.60时，第1类为亲本80，第2类为杂交后代与ztd。杂交后代中ln18、ln22、ln25遗传相异系数为0，ln11、ln12、ln14、ln17、ln27遗传相异系数为0(图4)。遗传相异系数都为0的菌株说明它们具有共同的遗传基因，为同一菌株。

表4 以80、ztd为亲本的酯酶同工酶相对迁移率

表5 以ztd和xy2为亲本的酯酶同工酶相对迁移率

由以168(ztd)和野生香菇(xy2)为亲本的聚类分析结果看出，xy2与其他菌株亲缘关系较远，单独为一类；杂交后代中几个菌株遗传距离较近，在遗传相异系数为0.32时聚为一类；ln23、ln30的遗传相异系数为0，为同一菌株；ln2、ln5、ln16的遗传相异系数为0，为同一菌株(图5)。

3 结论与讨论

本研究采用酯酶同工酶技术，对杂交亲本及其后代进行遗传差异研究，酯酶同工酶遗传分析结果表明，供试菌株酯酶同工酶酶谱带数为4～10条，迁移率在0.092～0.804之间，所有杂交后代与亲本之间既有共同酶带，又有属于自己的特征酶带，可初步认为供试的24个杂交后代有别于亲本。聚类分析结果表明，以931(59)、野生香菇(xy2)为亲本的杂交群体，这2个亲本菌株的遗传距离较远，在相异系数为0.68时分为2类，第1类为ln3、ln4、ln8，第2类为59和xy2；以931(59)、168(ztd)为亲本进行杂交，在遗传相异系数为0.78时分为3类，第1类为ln15，第2类为ztd、ln1、ln7、ln10，第3类为59，杂交后代中ln15与其他菌株亲缘关系较远；以荷香1号(80)、168(ztd)为亲本，在遗传相异系数为0.60时分为2类，第1类为亲本80，第2类为杂交后代与ztd；以168(ztd)和野生香菇(xy2)为亲本与杂交后代的聚类分析表明，野生菌株(xy2)与其他菌株亲缘关系较远，单独为一类，杂交后代几个菌株间遗传距离较近。聚类分析结果也初步鉴定了杂交亲本与后代之间的亲缘关系，为以后的栽培试验提供了理论依据。供试的24个杂交后代均为真实杂交后代，结果与前期杂交后代亲本拮抗呈阳性试验结果相符，说明酯酶同工酶技术可以作为鉴定杂交子真实性的标准之一。所有杂交后代中都具有特征酶带，可作为判断其他菌种是否为辽宁省农业科学院食用菌研究所选育菌株的依据之一。从聚类分析图可以初步看出杂交后代的遗传距离趋近于哪个亲本，至于农艺性状是否和聚类分析结果相符，还需要进行栽培性状比较试验。

中国香菇主栽品种遗传背景相对狭窄，而野生资源存在丰富的遗传多样性，有意识地应用野生种作为杂交亲本，是一种有效扩大栽培种遗传多样性的方法。为此，本研究将继续利用野生资源进行香菇新菌株选育，以保证香菇产业的可持续健康发展。