重组嗜热乳糖酶在毕赤酵母中的表达、纯化与活性分析

李洪波， 罗海燕， 张树琴， 吴东海

（1.怀化学院 生命科学系，民族药用植物资源研究与利用湖南重点实验室，湖南 怀化 418000；2.中国科学院广州生物医药与健康研究院，广东 广州510530）

随着年龄的增长，人体内乳糖酶活性呈规律性减退，产生乳糖不耐。据报道，我国超过一半的成年人有乳糖不耐受症状。乳糖酶是一种高效的生物催化剂，其在乳制品行业中不可替代。β-乳糖苷酶（βgalactosidase，EC 3.2.1.23），又称乳糖酶，能将乳或其制品中的乳糖水解为葡萄糖和半乳糖，降低乳制品中乳糖含量。活力强、耐高温重组乳糖酶的开发有助于简化乳糖转化工艺、降低生产成本、增加乳制品的附加值并扩大乳制品的适宜人群，有利于乳制品的普及、增加乳制品营养的吸收。乳糖酶多从酵母、曲霉或乳酸菌中提取获得，但由于耐热性差，严重影响其应用。耐高温乳糖酶能够克服这缺陷，从耐高温古细菌中分离热稳定性好的乳糖酶并克隆其基因，利用外源基因表达系统高效表达这些外源基因已成为研究和利用这些酶的重要突破点[1-5]。在外源基因表达系统中，毕赤酵母表达系统具有许多优点，例如：操作简易、易于培养、生长速度快、表达量高、酵母表达载体含分泌型信号肽利于胞外表达，高密度发酵生产成本低且该系统的安全性已得到美国FDA认可[6-8]。激烈热球菌虽然实现了在酵母中的分泌表达，但重组蛋白的纯化仍较复杂，本研究将利用毕赤酵母表达系统分泌表达带有组氨酸标签（His×6）的重组蛋白、纯化并检测其活性，为其耐热机理及其他方面活性研究奠定基础。

1 材料与方法

1．1 材料

P.furiosus乳糖酶（Lac）cDNA由佛罗里达大学李侍武教授馈赠，表达载体pPICZαA和表达菌株X-33由本实验室保存。PCR试剂及工具酶为TaKaRa产品；镍亲合树脂（Ni-NTA）购自Qiagen，抗体均购自CST公司，其他试剂为Sigma分析纯产品。培养基及配制参见毕赤酵母表达系统操作手册（Version E，010302/25-0150，Invitrogen）。

1．2 方法

1．2．1 载体的构建及转化酵母 据P.furiosus乳糖酶 cDNA（GenBank Accession No：gb|AF013169.2|），设 计 引 物 F：5′-GCCTCGAGAAAAGAATGAAGTT CCCAAAAAACTTC-3′和 R：5′-GCTCTAGATTT CTTGTAACAAATTTG-3′，PCR 扩增目的基因、构建质粒 pPICZαA/Lac并测序。pPICZαA/Lac经 Sac I线性化后参照毕赤酵母表达系统操作手册LiCl法转化酵母，涂布 YPDZ（Zeocin 100 mg/L），28 ℃培养3 d，将YPDZ平板上生长的酵母菌用2 mL液体YPD洗下、稀释并涂布到高浓度YPDZ平板（Zeocin 500 mg/L），28℃培养3 d，随机挑取转化子单菌落划线接种于YPDZ平板，28℃培养3 d，利用通用引物5′-Factor和3′-AOX1对转化子进行PCR验证。

1．2．2 小量表达及产物验证 转化子单菌落接种至10 mL BMGY，28℃、250 r/min培养过夜。取2 mL过夜菌于200 mL BMGY中，同上条件培养至A600=10左右；1 500 g、5 min离心得菌体。40 mL BMMY重悬菌体，500 mL三角瓶中，28℃、250 r/min诱导培养；每24 h取样1次并补甲醇至终体积分数1%，诱导4 d。测定上清酶活，SDS-PAGE分析上清中的蛋白，以抗His×6小鼠单抗为一抗，HRP标记山羊抗小鼠IgG为二抗，Western blotting检测目标产物。

1．2．3 扩大培养及蛋白纯化 按小量培养的方法，BMGY培养基培养1.2 L菌液，120 mL BMMY重悬菌体，诱导4 d后离心取上清，1 M Tris调节pH至8.0，15 000 g离心 10 min。参照文献[6]，将上清转至经20 mL缓冲液A平衡的镍柱，过柱后100 mL缓冲液B（缓冲液A含30 mmol/L咪唑）漂洗纯化柱，10 mL浓度分别为50、100、200和 300 mmol/L咪唑的缓冲液A洗脱。变性条件下，10%SDS-PAGE分析。纯化的重组蛋白经PBS透析后经超滤浓缩后备用。

1．2．4 酶学性质分析 配制pH 4～7的缓冲液，将ONPG溶于缓冲液（0.25%），于65℃测定酶活（牛奶巴氏灭菌温度下）。温度对酶活的影响：于40～100℃的水浴和105～120℃数显恒温油浴锅中，经1 h水浴后测定酶活。金属离子的影响：65℃、pH 6.5下，加入不同的金属离子和相关化学试剂（终浓度为1 mmol/L）测定酶活。酶比活测定：将酶蛋白质量浓度调整至 100 μg/mL，分别取 1、3、5 μL 添加至含有10 mL 0.25%ONPG的试管中，于最适条件下反应0.5 h测定并分析其比活。

1．2．5 乳糖水解分析 乳清粉配成一定浓度的溶液，100 ℃加热 15 min，6 000 r/min离心 10 min，取上清。调整乳糖浓度为5%，将纯化的酶蛋白质量浓度调整至 1 mg/mL，取 0、10、20、40 和 50 μL 添加至含有10 mL乳清溶液的试管中，于pH 6.5、65℃下、水解0.5 h，测定乳糖水解度。莱因-埃农氏法（GB/T 5413.5—1997）测定乳糖含量，酶-比色法（GB/T 16285—96）测定葡萄糖含量。水解率计算公式为：乳糖水解率=（生成葡萄糖的质量/原乳糖质量）×100%

2 结果与讨论

2.1 重组酵母表达载体的构建及酵母转化子的筛选

Xho I和 Xba I双酶切，电泳结果如图 1（a）所示，重组载体在15 00 bp处有DNA条带，该条带与目标基因大小相符 （泳道2）且测序结果与Gene Bank的序列一致，说明重组载体构建成功。随机挑取4个酵母转化子，PCR分析结果如图图1（b）所示，重组质粒转化子在约1 800 bp处存在特异条带（泳道3～6），而X-33出发菌株对照未出现特异扩增条带（泳道1），空载体转化子在约270 bp处存在条带（泳道 2），由于利用通用引物 5’-Factor和 3’-AOX1 PCR所得片段较目标基因大270 bp左右，PCR结果说明目标基因已成功插入到毕赤酵母基因组。

图1 载体的构建及转化子的验证Fig.1 Expression vector construction and PCR results of lactase P.pastoris transformants

2．2 小量表达及产物验证

甲醇诱导前，检测不到酶活，诱导24 h后的酶活达31 U/mL，诱导96 h酶活达到了125 U/mL（图2）。SDS-PAGE分析结果显示，在约55 kDa处有与目标蛋白大小相符的条带（图3），Western blot也显示在目标蛋白位置，出现了特异条带（图2）。SDSPAGE及蛋白印迹条带与预期重组乳糖酶的分子量大小相符。

2．3 重组蛋白的纯化

SDS-PAGE结果表明40和100 mmol/L咪唑的缓冲液A可将大部分杂蛋白漂洗掉，含200及300 mmol/L咪唑的缓冲液能将目标蛋白洗脱，当咪唑浓度为300 mmol/L时目标蛋白被大量洗脱且几乎没有杂蛋白（图4），Quantity One软件灰度分析结果表明，当咪唑浓度为300 mmol/L，洗脱液中目标蛋白纯度超过95%。SDS-PAGE分析结果表明，利用镍亲合纯化可以快速将目标蛋白分离纯化。纯化前诱导液总酶活达1.2×104U，酶比活力为320 U/mg，300 mmol/L咪唑洗脱后总酶活为3.3×103U，酶比活力约1 740 U/mg，经透析和超滤浓缩后，酶比活约1 800 U/mg，酶被纯化了5.6倍，各步纯化效果如表1所示。

图2 酶活变化曲线Fig.2 Enzyme activity curve

图3 目标蛋白的检测Fig.3 Identification of target protein

图4 重组乳糖酶的纯化Fig.4 Purification of recombinant lactase

表1 重组乳糖酶的纯化Table 1 Purification of recombinant lactase

2．4 酶特性分析

酶活温度曲线如5所示，105℃时重组酶的活力最高。酶活pH曲线如图6所示，pH 6.5左右酶活最高。 Cu2+、Fe2+、Mn2+和 Zn2+对乳糖酶有激活作用，Fe2+效果最明显，其相对酶活达到50%；EDTA、K+、Mg2+和Ca2+对酶的抑制作用不显著（图7）。酶比活力测定分析结果表明，该酶的比活达为1 850 U/mg。纯化酶的耐热性分析结果表明，该酶具有良好的热稳定性，经100℃处理2 h酶活在90%以上，100℃处理4 h酶活在70%以上（图8）。

图5 乳糖酶的温度曲线Fig.5 Optimum temperature curve of lactase

图6 乳糖酶的pH曲线Fig.6 Optimum pH curve of lactase

2．5 乳糖水解分析

乳糖酶的使用量与乳糖水解率的关系如图9所示，当重组酶添加量为37 U/g乳糖时，乳糖的水解度为16%；当乳糖酶的使用量为185 U/g乳糖时，乳糖的水解度达67%。以上结果说明，在巴氏灭菌条件下（65℃保温0.5 h），纯化的乳糖酶具有良好的水解乳糖活性。

图7 金属离子对酶活的影响Fig.7 Effect of metal ions to recombinant lactase activity

图8 乳糖酶的热稳定性曲线Fig.8 Thermostability curve of recombinant lactase

图9 乳糖水解分析Fig.9 Degree of hydrolysis of lactose

3 讨 论

国内外已有不少关于耐高温乳糖酶的研究报告[9-14]。段文娟等分别利用大肠杆菌表达了与本研究相同的乳糖酶基因，但其利用大肠杆菌表达系统表达的嗜热乳糖酶的酶活力较低且表达的重组酶存在于胞内，增加了蛋白分离纯化的工艺，不适于工业化生产[3，15]。Dong等[3]利用大肠杆菌表达的该重组酶经复性后才具有生物活性，但比活较酵母分泌表达的重组酶要低得多，且该复性酶的耐热性下降，其最适温度为90℃，最适pH为7，较本研究和Li等[2]表达的重组酶最适pH高，说明酵母表达系统较大肠杆菌更适于生产该重组酶。本研究利用毕赤酵母表达系统，在甲醇诱导下，重组嗜热乳糖酶在该表达系统中高水平分泌表达，摇甁小量培养条件下，经甲醇诱导的培养基上清液中的酶活达125 U/mL。该重组乳糖酶在pH 6～7间的酶活都在85%以上，该pH范围与天然牛乳的pH接近，且该酶具有广泛的温度适用范围；同时，以乳清为原料，在巴氏灭菌条件下，该酶表现出良好的水解乳糖活性。以上结果都表明酵母表达系统表达的重组嗜热乳糖酶在牛奶加工中具有广阔的应用潜力。

Li等[2]利用GAP为启动子，实现该酶组成型分泌表达，Li在高密发酵条件下酶产量约0.7 g/L，其高密发酵条件下菌体密度约为本研究50倍，目标产物为本研究10倍左右，说明以AOX1为启动子，在甲醇诱导下其表达量可能要高于GAP启动子；另外，酶学特性分析表明，本研究表达C-未端带组氨酸标签重组酶的酶学性质（最适pH、最适温度及热稳定性）与不带组氨酸标签基本一致。大多数蛋白的纯化步骤较多且过程繁琐，获得高回收率、高纯度蛋白的理想方法是尽量减少组化的步骤，本研究在目标蛋白的C端引入了组氨酸标签，上清液经调节pH后直接用于纯化，经镍亲合纯化后，优化洗脱条件，可以实现一步纯化获得高纯度的酶蛋白，该方法较离子交换更为简单，较利用热变性的方法去除其他蛋白更能保护酶的活性，有利于研究该酶的其他酶学特性、开展其他应用方面的分析及为其耐热机理等研究打下了良好的基础。