sucA缺失型大肠杆菌菌株的构建与发酵条件优化

林 凡 ， 张震宇 ， 孙付保 *， 于 林

（1.江南大学 生物工程学院，江苏 无锡 214122；2.工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122；3.糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122）

反式-4-羟脯氨酸属于不常见的氨基酸，其在医药、美容、化工、食品等领域均具有重要作用[1-3]，故近年来对其研究愈发增多。羟脯氨酸最初是在特定的蛋白中发现的，如胶原蛋白、肽类抗生素（放线菌素、绿灰菌素）[4]，目前主要是从动物胶原蛋白中分离提取获得[5]，但由于该方法需要复杂的纯化过程并会产生大量的废弃物[6]，所以研究酶转化生产羟脯氨酸具有现实必要性。

putA编码的PutA蛋白具有脯氨酸脱氢酶和吡咯啉-5-羧酸脱氢酶双重功能，在E.coli细胞中，该蛋白可以催化脯氨酸氧化生成谷氨酸，使得细胞内的脯氨酸积累量减少，不利于羟脯氨酸的生成。敲除putA基因可以有效提高由脯氨酸向羟脯氨酸的转化率[7]。在TCA循环中，α-酮戊二酸脱氢酶催化α-酮戊二酸到琥珀酸的过程[8-9]，sucA基因编码的是α-酮戊二酸脱氢酶复合体的E1亚基，敲除该基因可以使α-酮戊二酸脱氢酶活性丧失[10]。而来自于指孢囊菌并已进行密码子优化的反式-4-羟化酶基因（hyp）编码的酶可以将游离的L-脯氨酸转化为反式-4-羟脯氨酸[1，6]，同时将α-酮戊二酸转化为琥珀酸。利用此特点，以羟化酶基因取代sucA基因，使得菌株在生长的同时可以积累反式-4-羟脯氨酸。在此过程中，反式-4-羟脯氨酸的积累与细胞的生长相互偶联。此外，编码透明颤菌血红蛋白（VHb）的vgb基因可以通过提高氧气的传递而增强呼吸作用和能量代谢[11-12]，故在质粒上引入该基因对于长时间的发酵过程较为有利。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种与质粒 E.coli BL21（DE3）ΔputA为本实验室前期构建，E.coli JM109、E.coli BL21（DE3）为本实验室保存；表达载体pUC19-ptrp2-hyp-vgb（简称pUHVT4）为实验室之前构建的，质粒pET21a、pKD4为本实验室所有，质粒pKD46由他人惠赠，T载（pUCm-T）购自上海生工。

1.1.2 试剂与酶 实验中涉及的限制性内切酶、T4 DNA连接酶、rTaq DNA聚合酶、DNA Marker购自Takara（大连宝生物），Taq DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶购自上海生工。胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、胰蛋白胨和酵母提取物购自上海生工。其他的生化试剂购自国药。

1.1.3 引物 引物H1和H2用于合成sucA基因的上游同源臂，P1和P2用于合成卡那抗性基因（kan），引物H3和H4用于合成sucA基因的下游同源臂，同源臂选用长同源臂，引物设计参考文献[13]。其中，引物 H1的 5′端带有 Nde I酶切位点，H4的5′端带有Xho I酶切位点，用于基因片段与载体的连接；引物H2带有Hind III和BamH I酶切位点，用于羟化酶基因的插入；引物H2和P1、P2和H3反向互补，用于基因片段的融合。上述引物均由上海生工合成。

表1 研究中用到的引物Table 1 Primers used in the research

1.2 方法

1.2.1 含有打靶片段载体的构建 扩增获得sucA基因的上、下游同源臂和卡那抗性基因，将三者以摩尔比1∶1∶1进行混合，以H1和H4为引物，扩增获得3个基因片段的融合片段[14-15]。将融合片段与T载（pUCm-T）以 7∶1～10∶1 的比例混合，用 T4 DNA连接酶进行连接后导入E.coli JM109，载体命名为pUCm-T-AK，连接体系和条件参照Takara说明书。之后用Xho I和Nde I双酶切载体pUCm-T-AK获得含有酶切位点的融合片段，与同样双酶切的pET21a进行连接，载体命名为pET21a-AK。Hind III和BamH I双酶切质粒pUHVT4获得hyp基因，与同样双酶切的质粒pET21a-AK进行连接，载体命名为pET21a-AKH，从而获得含有打靶片段的载体。

1.2.2 sucA基因敲除菌的获得 本次基因敲除是基于Red重组系统进行的，具体实施步骤参考文献[16-18]。

1.2.3 发酵液中羟脯氨酸的测定 采用比色法测定发酵液中的羟脯氨酸含量，反应原理与具体实验步骤参考文献[19]。

1.2.4 初步筛选高产菌株 将质粒pUHVT4转入E.coli BL21（DE3）ΔputAΔsucA 的转化子中，35 ℃，220 r/min进行发酵 ，比色法测定羟脯氨酸的产量，将最为高产的菌株作为后续实验的研究对象。提取该菌株的基因组，以Y1和H4为引物，PCR获得打靶片段所在的基因片段，并测序。

1.2.5 全细胞酶活测定 在平板上划线后，挑取单菌落接种LB液体培养基，37℃培养12 h，测定菌的全细胞酶活，测定方法参考[1，4]。其中，1个单位酶活的定义为：1 min催化反应得到1 μmol反式-4-羟脯氨酸的酶量，单位为U；全细胞酶活为每g干菌体的酶活，单位为U/DCW。

1.2.6 重组菌株发酵条件的优化 种子培养：挑取活 化 后 的 E.coliBL21 （DE3）ΔputAΔsucA（pUHVT4）单菌落接种到含有抗生素的30 mL（250 mL锥形瓶）LB培养基中，37℃，220 r/min培养8 h。发酵培养：将种子液以6%的接种量接入30 mL（250 mL锥形瓶）发酵培养基中，35℃，220 r/min培养12 h。在摇瓶水平优化发酵培养基的组分与发酵条件下，确定较优的培养基组分。 包括葡萄糖（0、2、4、8、12、16 g/L）和甘油（0、3、6、10、14 g/L）、玉米浆（8、12、16、20、24 g/L）、K2HPO4（1.5、9、11、14、17、25 g/L）、（NH4）2SO4（0、3、8、13、17、21 g/L）和 FeSO4浓度 （0、1、2、3、4 mmol/L） 以及 pH（6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5），之后进行正交实验。

2 结果

2.1 sucA基因的上、下游同源臂、卡那抗性基因以及融合片段的获得

以提取的E.coli BL21（DE3）的基因组为模板，以H1、H2和H3、H4为引物，PCR获得sucA基因的548 bp的上游同源臂和591 bp的下游同源臂。以质粒pKD4为模板，以P1和P2为引物，获得大小为1 521 bp的kan基因片段（图1）。三者混合，PCR获得大小为2.6 kb的片段。

图1 基因敲除用PCR片段的电泳图谱Fig.1 Electrophoresis maps of PCR products for gene deletion

2.2 含有打靶片段的载体构建

重组质粒pUCm-T-AK，用引物H1和H4作为验证引物，以提取的质粒为模板，PCR获得大小为2.6 kb的条带为正确质粒。质粒pET21a-AK用Hind III单酶切获得大小为8 049 bp的条带，Xho I和Hind III得到大小分别为2 093 bp和5 956 bp的两条条带，凝胶电泳图谱见图2。

2.3 E.coli△putA菌株的sucA基因敲除

以提取的质粒pET21a-AKH为模板，以H1和H4为引物，获得大小为3.4 kb的打靶片段。电转后的转化子以引物Y1和P2作为验证引物，在NCBI里将该引物与E.coli BL21（DE3）的基因组比对后没有条带，缺失菌经菌落PCR扩增则获得大小为3 kb的电泳条带。验证正确的 E.coli BL21（DE3）ΔputAΔsucA（BPAP）转化子有 4个，分别导入质粒pUHVT4。初始脯氨酸浓度为8 mmol/L，发酵12 h的发酵结果如图3所示，选用羟脯氨酸产量最高的3号菌株作为后续的实验对象。提取3号菌株的基因组，以Y1和H4为引物进行PCR，将获得的PCR片段进行测序，测序结果表明，羟化酶基因成功重组到基因组上。

图2 pET21a-AK单、双酶切Fig.2 Double digests of pET21a-AK

图3 4个转化子的发酵结果Fig.3 Fermentation results of converters

2.4 各种菌株的全细胞酶活测定

测定 E.coli BL21 （DE3）、E.coli BL21（DE3）（pUHVT4）、E.coli BL21（DE3）ΔputA（pUHVT4）、E.coli （DE3）ΔsucA （pUHVT4）、E.coli BL21 （DE3）ΔputAΔsucA（pUHVT4）五株菌株的全细胞酶活，结果见图4。从测定结果看，菌株E.coli BL21（DE3）ΔputAΔsucA（pUHVT4）的全细胞酶活最高，其次是E.coli BL21（DE3）ΔsucA（pUHVT4）和 E.coli BL21（DE3）ΔputA （pUHVT4）， 均高于原菌 E.coli BL21（DE3）（pUHVT4），说明不论单基因敲除还是双基因敲除均有利于提高细胞的全细胞酶活。其次，E.coli BL21（DE3）ΔsucA（pUHVT4）的全细胞酶活高于菌 E.coli BL21（DE3）ΔputA（pUHVT4），说明从全细胞酶活来看，敲除基因sucA后的产羟脯氨酸的效果要好于敲除基因putA。而菌株E.coli BL21（DE3）ΔputAΔsucA（pUHVT4）的全细胞酶活高于任何一个单敲除菌，说明两个基因的敲除效果是相互叠加的却又不是简单的相加效果。

图4 不同菌株的全细胞酶活Fig.4 Whole cell activity of strains

2.5 发酵单因素优化

2.5.1 碳源对反式-4-羟脯氨酸产量的影响 在不加甘油的前提下，对葡萄糖的质量浓度进行优化。从图5来看，不加葡萄糖时，OD600与羟脯氨酸的产量远低于其他浓度，但是羟脯氨酸的产量也在160 mg/L左右，分析原因可能是：发酵用的玉米浆中含有还原糖，可以为微生物提供少量的碳源。葡萄糖质量浓度为2 g/L时的OD600远高于不加葡萄糖，但在高于2 g/L之后便没有明显的变化，而羟脯氨酸的产量则在葡萄糖质量浓度为4g/L时达到了最高值。在葡萄糖添加质量浓度为4 g/L的条件下，优化甘油的浓度。从图6来看，甘油质量浓度对OD600没有明显的影响，而羟脯氨酸的产量则在甘油质量浓度为6 g/L时达到了最大值。

2.5.2 氮源对反式-4-羟脯氨酸产量的影响 玉米浆中富含多肽、多糖、亚硫酸、蛋白质以及多种氨基酸，这些成分多作为发酵生产氨基酸的前提物质。在发酵生产过程中除了作为氮源，玉米浆中的生长因子尤其是生物素对氨基酸的生产也有促进作用，故以玉米浆作为发酵有机氮源，成本低廉并且有效[20]。从图7来看，玉米浆的添加有利于菌体的生长，在低于20 g/L时有利于羟脯氨酸的生成，但添加量高于20 g/L时，羟脯氨酸的产量不但没有提高，反而有所下降。最终优化后，将最适的玉米浆质量浓度定为20 g/L。

图5 葡萄糖对反式-4-羟脯氨酸产量的影响Fig.5 Effect of glucose on trans-4-hydroxyproline

图6 甘油对反式-4-羟脯氨酸产量的影响Fig.6 Effect of glycerol on trans-4-hydroxyproline

图7 玉米浆对反式-4-羟脯氨酸产量的影响Fig.7 Effectofcorn steep liquor on trans-4-hydroxyproline

2.5.3 K2HPO4对反式-4-羟脯氨酸产量的影响对K2HPO4的质量浓度进行优化，发现其对羟脯氨酸产量的影响最为显著。从图8来看，在K2HPO4的质量浓度低于17 g/L时，OD600随着K2HPO4的添加逐渐升高，当质量浓度高于17 g/L时，OD600有所下降。而羟脯氨酸的产量在质量浓度为11 g/L时达到了最高值，由初始培养基的216 mg/L达到了753 mg/L。分析原因：K2HPO4为微生物的生长与氨基酸的发酵提供磷、钾元素；同时，K2HPO4水溶液呈微碱性，可以与酸性物质反应生成KH2PO4，KH2PO4则与碱性物质反应生成 K2HPO4，K2HPO4与KH2PO4的酸碱性均不强，可以将发酵体系的pH维持在较为稳定的范围。

图8 K2HPO4对反式-4-羟脯氨酸产量的影响Fig.8 Effect of K2HPO4on trans-4-hydroxyproline

2.5.4 （NH4）2SO4对反式-4-羟脯氨酸产量的影响发酵过程中，（NH4）2SO4既可以作为无机氮源，同时NH4+是一种较好的缓冲离子，在某种程度上可以调节pH。其质量浓度对羟脯氨酸产量的影响如图9所示，在（NH4）2SO4质量浓度低于 17 g/L 时，OD600随着 （NH4）2SO4的添加而升高，当添加质量浓度高于17 g/L时，OD600开始下降。而羟脯氨酸的产量则在（NH4）2SO4质量浓度为13 g/L时达到了最高值。

图9 （NH4）2SO4对反式-4-羟脯氨酸产量的影响Fig.9 Effect of（NH4）2SO4on trans-4-hydroxyproline

2.5.5 FeSO4对反式-4-羟脯氨酸产量的影响 脯氨酸羟基化生成羟脯氨酸的过程是由反式-4-羟化酶催化的，而反式-4-羟化酶属于2-酮戊二酸依赖型双加氧酶家族，该酶的催化过程需要Fe2+的参与[6]。从图10来看，OD600随着FeSO4浓度的升高而升高，也就是说，适量的添加亚铁离子有利于菌体的生长。当不添加FeSO4时，仍有较高的羟脯氨酸产量，可能是由于玉米浆中含有一定浓度的铁元素。最终优化结果表明，羟脯氨酸的产量在FeSO4浓度为1 mmol/L时达到了最高值。

图10 FeSO4对反式-4-羟脯氨酸产量的影响Fig.10 Effect of FeSO4on trans-4-hydroxyproline

3.5.6 pH对反式-4-羟脯氨酸产量的影响 发酵培养液的初始pH会直接影响菌株的生长与代谢活动[21]，随着发酵过程的进行，培养基成分的改变和微生物的代谢产物都会使pH发生极大变化。从图11来看，随着初始pH的增大，菌体OD600有所升高，但当pH到9.5时，菌体的生长受到极大的抑制，几乎不能够进行生长。而羟脯氨酸的积累量随着pH的增大而逐渐升高，在pH为8.5时达到了最大值，之后迅速下降。表明，过碱的环境会严重抑制菌的生长与羟脯氨酸的产生。

图11 pH对反式-4-羟脯氨酸产量的影响Fig.11 Effect of pH on trans-4-hydroxyproline

3.5.7 正交实验 根据单因素优化的结果，进行正交实验，正交因素和水平以及正交结果分别如表2和表3所示。

表2 正交实验因素水平Table 2 Factors level of orthogonal experiment

表3 正交实验结果Table 3 Results of orthogonal experiment

由表中的极差得到因素的主次顺序依次为：（NH4）2SO4（E）＞玉米浆（C）＞Fe2+（G）＞葡萄糖（A）＞甘油（B）＞K2HPO4（D）＞NaCl（F），得到的最佳组合：A2B3C1D2E1F1G2，即葡萄糖 4 g/L，甘油 10 g/L，玉米浆16 g/L，K2HPO411 g/L，（NH4）2SO4 8 g/L，NaCl 0.75 g/L，MgSO40.3 g/L，CaCl20.005 g/L，FeSO41 mmol/L。优化后的发酵培养基验证：同样培养条件下，培养基优化前的反式-4-羟脯氨酸产量为0.28 g/L，培养基优化后的反式-4-羟脯氨酸产量为1.08 g/L，是优化前的3.87倍。

3 结 语

本文在 E.coli BL21（DE3）ΔputA 的基础上，进一步敲除了基因sucA并在基因组上引入羟化酶基因（hyp）。但由于基因组上的表达量不够高，故导入辅助质粒pUC19-ptrp2-hyp-vgb，其中，vgb基因能够提高细胞的溶氧，对于长时间的发酵过程较为有利。实验室前期进行菌株 E.coli BL21（DE3）（pUHVT4）的培养基优化，在初始脯氨酸400 mmol/L，发酵24 h后的反式-4-羟脯氨酸产量为0.97 g/L。而构建的突变菌优化发酵培养基后，在初始L-脯氨酸为100 mmol/L，发酵12 h时的产量为1.08 g/L，相比较而言，双敲除菌 E.coli BL21（DE3）ΔputAΔsucA（pUHVT4）具有明显优势，不仅缩短了发酵时间，而且提高了脯氨酸的转化率。

接下来需在摇瓶优化的基础上，进行发酵罐的放大实验，通过流加葡萄糖，维持重组大肠杆菌的持续生长从而不断积累反式-4-羟脯氨酸，为工业化生产做准备。