热带假丝酵母肉毒碱乙酰基转移酶基因的删除及功能鉴定

张利华 ， 陈献忠 *， 陈 振 ， 沈 微 ， 樊 游

(1.工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122；2.江南大学生物工程学院，江苏 无锡214122）

热带假丝酵母（Candida tropicalis）是一种二倍体非常规假丝酵母，能够产生芽管和假菌丝[1]，不存在有性生殖阶段，仅存在准性生殖过程[2]，遗传背景相对于酿酒酵母等常规酵母更为复杂。目前，热带假丝酵母已经被成功运用于长链二元有机酸的工业化生产中[3]，并且在微生物发酵法生产木糖醇[4-5]、生物乙醇[6]、氢气[7]以及工业有机废水处理等方面展现出很高的应用潜力。

代谢工程是工业微生物育种的重要手段，然而热带假丝酵母的遗传操作相较于模式酵母菌株更为困难。Hara等人[8]以密码子优化的潮霉素B抗性基因作为筛选标记对C.tropicalis M12103A双拷贝的URA3基因进行连续敲除，高弘等人[9]则依次用潮霉素B和G418作为筛选标记，对双拷贝的CAT基因进行破坏，而Lu[10]和Chen[11]等人则采用基于白假丝酵母密码子优化的诺尔丝菌素抗性基因作为筛选标记对热带假丝酵母进行多基因连续破坏。然而，龚毅等人[12]的研究表明热带假丝酵母CT750菌株对G418、潮霉素和腐草霉素等抗生素的敏感性较差，不能作为该菌株的显性筛选标记。笔者前期实验结果也表明潮霉素或腐草霉素作为选择标记转化热带假丝酵母ATCC20336也很难成功（未发表）。此外，热带假丝酵母存在密码子偏好性，将CUG密码子翻译成丝氨酸，而非通用密码子的亮氨酸[13]，进一步限制了抗性基因作为筛选标记的普适性。

Haas等人[14]通过亚硝基胍诱变筛选获得尿嘧啶营养缺陷型菌株，然后将其作为宿主建立了最早的热带假丝酵母DNA整合转化系统。利用该转化系统，Picataggio等人[15]对热带假丝酵母β氧化途径的限速酶POX4和POX5两对等位基因进行了连续敲除，获得了β氧化途径阻断的工程菌株，建立了连续的基因敲除系统。然而，在利用该技术进行多基因删除时，每完成一个基因的单拷贝敲除，就必需通过自发突变或者分子手段来破坏URA3标记，从而达到在同一细胞中连续使用同一筛选标记的目的，这即延长了育种周期，增加了工作量，又增加了多基因敲除的难度。Cheng等人[16]通过发展一种源于酿酒酵母的Ura-blaster基因连续敲除系统，成功完成了对热带假丝酵母FAOT基因的单拷贝和双拷贝敲除。这套Ura-blaster基因连续敲除系统中，URA3基因两侧分别插入了一段源于沙门氏菌（Salmonella）的1.1 kb的HisG直接重复序列，当携带靶基因同源臂的删除盒整合到染色体后，随着酵母染色体的复制，两段HisG序列会发生同源重组从而环化弹出URA3基因，达到重复利用标记基因的目的。本实验室项峥等人[17]也利用这套转化系统对PDC基因进行了连续敲除，进一步验证了该方法的普适性。此外，以一些Ura-blaster的变形形式（如以leu、glu和trp等基因片段替代HisG序列）也被应用于热带假丝酵母的基因删除[18-19]，丰富了Urablaster基因删除系统在热带假丝酵母中的应用。然而，构建DNA删除盒中较长的重复序列不仅增加了分子操作的难度，而且在PCR扩增时由于有一定几率发生重复片段的重组，从而也降低了制备目的片段的效率。

本研究选用热带假丝酵母ATCC20336的尿嘧啶营养缺陷型突变菌株XZX为宿主，构建了以gda片段作为基因删除辅助序列的肉毒碱乙酰基转移酶（CAT）基因删除突变盒（CAT1-gda-URA3-CAT1和CAT2-gda-URA3-CAT2），利用双交换的原理，通过氯化锂转化法两次转化宿主菌株，获得CAT基因单拷贝敲除和双拷贝敲除突变株，并对CAT的基本功能进行了分析，探讨其在热带假丝酵母烷烃代谢中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与引物 本实验所涉及到的菌株和引物见表1与表2。热带假丝酵母尿嘧啶营养缺陷型菌株XZX由本实验室经野生型热带假丝酵母ATCC20336通过化学诱变获得[17]。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 本实验所用到的菌株Table 1 Strains used in this paper

表2 本实验所用到的引物Table 2 Primers used in this paper

1.1.2 主要试剂及工具酶 限制性内切酶Pst I、Sal I和Xba I，T4 DNA连接酶等工具酶以及克隆载体pMD18-T载体、pMD18-T Simple载体均购自大连宝生物工程有限公司；5-氟乳清酸 （5-FOA）购自Amresco（美国），酵母粉和蛋白胨购自 OXOID（英国），酵母氮基（YNB）购自 Bio Basic Inc（加拿大），其他试剂均购自上海生工生物工程有限公司。

1.1.3 培养基 MM培养基、SM培养基以及2×FOA培养基均参照文献 [17]；十二烷培养基：YNB 0.67%，硫酸铵1%，十二烷2%，尿嘧啶0.006%。

1.2 方法

1.2.1 CAT基因敲除突变盒的构建 根据NCBI中热带假丝酵母的CAT基因 （GenBank登录号：D84549.1）和 URA3基因 （GenBank登录号：AB006207）序列设计一系列引物，引物序列和相关酶切位点见表2。

以质粒T-URA3[17]为模板，Ugda324/Dgda为引物进行PCR扩增，获得长度为324 bp的基因删除辅助序列（gda序列），经限制性内切酶Pst I和Sal I消化后插入到质粒T-URA3中相应的酶切位点，获得重组质粒T-gda324-URA3。

以热带假丝酵母XZX菌株的染色体DNA为模板，CATU/CATR、CAT2ndU/CAT2ndR 为 引 物 ，PCR扩增1.9 kb的CAT1和0.9 kb的CAT2基因片段，分别插入pMD18-T Simple载体中，获得重组质粒Ts-CAT1和Ts-CAT2。以质粒Ts-CAT1为模板，rCATU/rCATR为引物，通过反向PCR扩增获得具有敲除第一个CAT等位基因同源臂的线性化DNA片段 （CAT1-Ts-CAT1）；以质粒Ts-CAT2为模板（CAT2基因片段位于两个 CAT1同源臂之间），rCAT2ndU/rCAT2ndR为引物，反向PCR获得携带敲除第二个CAT等位基因同源臂的DNA片段（CAT2-Ts-CAT2）。

用限制性内切酶Pst I和Xba I消化质粒T-gda324-URA3，回收gda324-URA3片段，然后分别插入到经相应酶消化的CAT1-Ts-CAT1和CAT2-Ts-CAT2片段，获得重组质粒Ts-CAT1-gda324-URA3和Ts-CAT2-gda324-URA3。以重组质粒Ts-CAT1-gda324-URA3为模板，CATU/CATR为引物，通过PCR获得敲除第一个CAT等位基因的敲除盒CAT1-gda324-URA3-CAT1；以Ts-CAT2-gda324-URA3为模板，CAT2ndU/CAT2ndR为引物，PCR扩增获得敲除第二个CAT等位基因的敲除突变盒CAT2-gda324-URA3-CAT2。

1.2.2 酵母的转化与鉴定 热带假丝酵母的转化参考文献[17]。将第一个基因敲除突变盒转化XZX菌株，在基本培养基上筛选转化子，挑取单菌落提取基因组DNA，以CATU和位于CAT1基因片段下游的引物CATLD为引物进行PCR鉴定，验证正确的转化子命名为01菌株；01菌株的URA3标记基因剔除后获得突变菌株，命名为02菌株，然后将01菌株和02菌株送上海生工生物工程有限公司测序。转化第二个CAT基因敲除突变盒进入02菌株，以CAT2ndU/CATR为引物进行PCR鉴定，验证正确的菌株命名为03；03菌株丢失标记基因获得04菌株，然后送上海生工生物工程有限公司测序。

1.2.3 标记基因的剔除 将01菌株的单菌落接种于SM液体培养基中，30℃、200 r/min摇瓶培养，待菌体达到对数生长期的后期时，直接吸取200 μL涂布2×FOA平板，将平板置于30℃培养，3 d后挑取2×FOA平板上单菌落转接到2×FOA培养基培养，提取染色体DNA并进行PCR鉴定。保藏URA3标记基因弹出的突变菌株，并用于第二个CAT等位基因的敲除。03菌株按照同样的方法剔除标记基因。

1.2.4 CAT酶活测定 将热带假丝酵母突变株02、04和亲本菌株XZX单菌落分别接种于SM液体培养基中培养，待菌体达到一定浓度后转接到添加了2%的十二烷的SM液体培养基中诱导培养48 h。参考文献[20]制备CAT粗酶液，CAT酶活性测定参考文献[21]报道的DTNB法。

2 结果与分析

2.1 CAT基因敲除质粒的构建

设计方案构建携带CAT基因敲除突变盒的重组质粒Ts-CAT1-gda324-URA3和Ts-CAT2-gda324-URA3。 分别用 Pst I/Sal I（329 bp、4 933 bp）和 Pst I/Xba I（1 923 bp、3 339 bp）双酶切质粒 Ts-CAT1-gda324-URA3进行鉴定，限制性酶切产物大小与理论值一致，表明重组质粒Ts-CAT1-gda324-URA3构建正确 （图1（a））；重组质粒Ts-CAT2-gda324-URA3转化大肠杆菌JM109后，Xba I酶切位点发生Dam甲基化，不便于用限制酶切鉴定，重组质粒经DNA测序分析正确。

图1 基因敲除质粒与敲除突变盒的鉴定Fig.1 Identification ofrecombinantplasmids and disruption cassettes

2.2 CAT基因敲除突变盒的鉴定与获得

基因敲除突变盒的获取方式如图2（a）所示。以鉴定正确的重组质粒为模板，CATU/CATR或CAT2ndU/CAT2ndR为引物，通过PCR扩增出CAT基因敲除突变盒CAT1-gda324-URA3-CAT1（2 570 bp）和CAT2-gda324-URA3-CAT2（2 646 bp）（图 1（b）），PCR产物经纯化后用于酵母转化。

2.3 热带假丝酵母CAT基因的敲除

热带假丝酵母CAT基因敲除流程如图2（b）所示。通过氯化锂转化法将敲除盒CAT1-gda324-URA3-CAT1转化热带假丝酵母XZX菌株，从MM培养基平板上挑取长出的转化子单菌落培养后，提取染色体DNA，以CATU/CATLD为引物进行PCR鉴定，阳性转化子PCR产物大小为2.7 kb（图3，泳道1），对照（以XZX菌株染色体DNA为模板）大小为2.0 kb（图 3，泳道 3），鉴定正确菌株命名为01。测序分析发现01菌株中的一个CAT基因位点被敲除盒CAT1-gda324-URA3-CAT1替换（测序结果未列出）。

为重复利用URA3基因作为筛选标记进行双拷贝的CAT基因敲除，将01菌株涂布2×FOA平板，经过3 d培养后筛选URA3基因随机丢失的突变株。提取2×FOA平板上突变株染色体DNA，以CATU/CATLD为引物进行PCR鉴定，产物大小为1.1 Kb的突变株为URA3标记基因弹出突变株（图3，泳道2），命名为02。测序分析发现单拷贝的gda序列和两个同向gda序列之间的URA3基因片段丢失，仅残留单拷贝的gda序列。

将第二个敲除盒CAT2-gda324-URA3-CAT2转化02菌株，按照上述方法提取染色体DNA，以CAT2ndU/CATR为鉴定引物进行PCR验证，敲除盒正确整合的转化子扩增产物为3.0 kb（图3，泳道4），对照菌株PCR产物大小为1.3 kb（图3，泳道6），鉴定正确菌株命名为03。03菌株涂布2×FOA平板，筛选获得标记基因丢失菌株，经PCR鉴定和DNA测序分析验证正确的菌株命名为04（图3，泳道5）。

2.4 CAT基因敲除对菌株生长的影响

图2 热带假丝酵母CAT基因敲除流程图Fig.2 Sequential gene disruption of CAT in C.tropicalis

图3 CAT基因敲除菌株的PCR鉴定Fig.3 PCR identification of CAT gene knockout mutants

分别将热带假丝酵母突变株02、04和XZX菌株的种子液以一定比例接种于SM液体培养基或将种子用无菌水洗涤后接入十二烷培养基中培养，定时取样测定OD600，结果如图4所示。当葡萄糖为唯一碳源时，CAT基因单拷贝缺失菌株02的生长状况与亲本一致，而CAT双拷贝敲除菌株的生物量明显下降（4（a））。02菌株在以十二烷为唯一碳源时，生长状况与亲本菌株差异不明显，而CAT基因的双缺失导致04菌株无法代谢烷烃（图4（b））。结果表明热带假丝酵母CAT基因不仅是烷烃β氧化过程所必需，而且CAT双拷贝缺失也显著影响突变株在以葡萄糖为碳源的培养基中的生长。由于葡萄糖的代谢过程并不需要CAT的参与，具体的机理值得进一步研究。

图4 菌株02、04和XZX的生长曲线Fig.4 Comparison of the growth characteristics of 02，04 and XZX

2.5 CAT基因缺失的功能鉴定

为了考察CAT基因的敲除对突变株中相应酶活力的影响，分别将02、04和XZX菌株接种于添加了2%十二烷的SM液体培养基中诱导CAT基因表达，然后测定胞内的CAT酶活力，结果如图5所示。相比于亲本菌株，02菌株的CAT活力下降了约80%，而在CAT双缺失菌株中，几乎检测不到CAT活性，表明热带假丝酵母中的肉毒碱乙酰基转移酶活性完全由双拷贝的CAT基因控制。但是，CAT基因单拷贝缺失突变株02在烷烃为碳源的培养基中的生长速率并没有受到显著影响（图4（b）），推测染色体中单个CAT基因的表达已经满足了烷烃β氧化所需的酶活水平。

图5 热带假丝酵母转化子胞内CAT活性分析Fig.5 Assay of CAT activity in each strain

3 结论与讨论

传统的热带假丝酵母基因连续删除系统中，为达到重复利用单一标记基因对同一菌株进行连续基因删除的目的，通常在URA3基因两侧插入两个同向重复的HisG序列，从而在随后的染色体复制过程中随机同源重组，剔除URA3基因和单拷贝的HisG序列[5，16-17]。然而两个1.1 kb的HisG重复序列很容易在PCR扩增过程中发生高频率的同源退火反应，从而剔除URA3基因，导致PCR扩增基因删除突变盒时效率较低，而且两个HisG重复序列还可能导致基因敲除突变盒长度过大，增加PCR扩增和后续转化的难度。

本研究发展了一种更为高效的多基因删除策略，即直接从URA3基因的3'端扩增一段短片段（gda序列）作为基因删除辅助序列，直接插入URA3基因的5'端（gda-URA3），然后在两侧连接靶基因的同源臂，利用同源重组的原理对热带假丝酵母菌株进行连续的基因敲除。在所构建的基因敲除突变盒中，gda序列与URA3基因中的3'端序列形成同向重复（图2），该重复序列可以在染色体复制过程中发生随机的同源重组，从而特异性的剔除单拷贝的gda序列和两段同向的gda序列之间的URA3基因片段。利用此策略，本文成功删除了热带假丝酵母菌株双拷贝的CAT基因。进一步验证了CAT基因删除对细胞的生理影响，结果表明02菌株的酶活性相比于亲本菌株损失了约80%，单拷贝CAT基因的敲除对菌体生长代谢的影响作用不明显，推测在热带假丝酵母烷烃代谢过程中少量的CAT酶活性足以完成中间产物在线粒体和过氧化物酶体之间的转移。另外，02菌株十二碳二元有机酸的摇瓶发酵并不能大量积累有机酸（数据未列出），表明该菌株中的β氧化途径仍能正常进行。另外，实验结果表明双拷贝CAT基因不仅导致β氧化途径的中断，而且显著影响菌株在葡萄糖为碳源的生长性能。关于CAT与葡萄糖代谢之间的关系，尚未有确切的文献报道，这将是我们后续工作的一个关注点。此外，本研究所采用的基因删除辅助序列的大小、位置等因素对基因删除效率的影响也是后续研究的重点。

目前，工业化生产木糖醇主要通过玉米芯等农副产品的水解、氢化工艺生产[22]，但是该方法生产过程复杂、安全要求高[23]。热带假丝酵母菌的生物转化法是具有潜力的木糖醇生产方法。利用本文建立的基因删除策略改造热带假丝酵母的木糖代谢途径，提高木糖醇转化效率，是未来发酵法生产木糖醇的研究方向。