巴戟天含药血清对人骨肉瘤MG63细胞凋亡及JNK信号通路的影响

王亚非，邢姝琴，尉志强，黄江海，刘 洁，胡 岳，李运海

(北京中医药大学东方医院 骨科，北京 100078)

骨肉瘤是较常见的发生在青少年或儿童的一种恶性骨肿瘤，在小儿骨恶性肿瘤中最多见，约为小儿肿瘤的5%[1]。随着医疗技术的迅猛发展，经手术联合化疗后，骨肉瘤患者的5年生存率已提高到约50%～70%，但化疗药物的耐药性及存在的严重毒副作用使得治疗效果难以令人满意[2]。近年来，在祖国传统中医药中寻找疗效显著且毒副作用小的抗肿瘤药物是研究热点之一。巴戟天是我国“四大南药”之一，具有补肾阳、强筋骨等功效，研究表明，巴戟天含药血清能促进成骨细胞生成，抑制破骨细胞分化，升高成/破骨细胞比例，降低骨代谢，保护骨组织[3]。巴戟天作为治疗骨肉瘤中药复方中的常见药物，其单味药或有效成分对骨肉瘤细胞增殖抑制的相关报道却甚少。JNK信号通路是MAPK家族中三条经典的凋亡通路之一，在细胞凋亡尤其是肿瘤细胞的凋亡过程中扮演了关键角色[4]。本研究以人骨肉瘤MG63细胞为研究对象，采用MTT、流式细胞术、Hoechst荧光染色、Western-blotting等实验技术研究巴戟天含药血清对MG63细胞的增殖和凋亡的影响，并从JNK通路探讨潜在的作用机制，为阐明巴戟天抗肿瘤活性及其临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 SPF级4周龄SD大鼠12只，雌雄各半，体质量200～220 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证为SCXK(京)2016-0006；人骨肉瘤MG63细胞株(北纳创联)；DMEM培养基(美国Gibco)；兔抗鼠JNK、p-JNK、Bad、p-Bad、Cleaved caspase-3多克隆抗体(英国Abcam)；IgG-HRP标记的山羊抗兔多克隆抗体(武汉博士德)；MTT粉末、Hoechst 33258染液(上海碧云天)；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基生物)；巴戟天颗粒(北京康仁堂药业有限公司)；CO2培养箱、酶标仪(美国Thermo)；倒置荧光显微镜(日本OLYMPUS)；流式细胞仪(美国BD)；凝胶成像分析仪(美国Bio-Rad)。

1.2 含药血清的制备 12只SD大鼠随机分为4组，包括空白组和低、中、高剂量巴戟天组，每组3只。低、中、高剂量组分别给予0.54、1.08、2.16 g/kg的巴戟天药液(相当于临床等效剂量的2、1、0.5倍)，以10 mL/kg灌胃，空白组则给予等体积蒸馏水。每天上、下午固定时间各给药1次，连续灌胃3 d，第4天上午灌胃完成后1 h，各组大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉(3 mL/kg)，腹主动脉取血，室温静置2 h，于3 000 rpm条件下离心10 min，分离血清，56 ℃水浴下灭活30 min，分装、保存备用。

1.3 细胞培养 人骨肉瘤MG63细胞株所用培养基为含10%胎牛血清的DMEM培养基，于37 ℃、5%CO2饱和湿度下培养，每隔2～3 d胰酶消化并传代，定时更换培养液。

1.4 MTT法检测细胞增殖率 取处于对数生长期的人骨肉瘤MG63细胞，胰酶消化后，调整细胞浓度至5×104个/mL，每孔100 μL分别接种于两块96孔板中。待细胞完全贴壁后，弃去培养液。设置低、中、高浓度巴戟天含药血清组，同时设置空白组和对照组，空白组除不加细胞悬液外其余同药物组，对照组则加入空白血清，每组设置6个复孔。于培养箱中分别培养24、48 h后，加入MTT液避光孵育4 h，然后加入DMSO液，室温下振荡10 min，于酶标仪450 nm波长处测定各孔的吸光度值(A值)，并计算细胞增殖率：增殖率/% =(A药物组-A空白组)/(A对照组-A空白组)×100%。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡率 消化并收集MG63细胞于离心管中，每组细胞数为1×106个/mL，1 000 rpm条件下离心5 min，去除上层液体，并加入PBS液洗涤两次，每管加入200 μL的Binding Buffer液悬浮细胞，然后加入5 μL Annexin V-FITC液，混匀，再加入5 μL Propidium Iodide(PI)，混匀，4 ℃避光反应30 min，流式细胞仪上机检测，采用Cell Quest软件分析得出各组细胞的凋亡率。

1.6 Hoechst 33258荧光染色检测细胞凋亡形态 将处于对数生长期的MG63细胞以每孔5 000个接种至96孔板内，培养24 h后，对照组与药物组分别加入空白血清和低、中、高浓度的含药血清，每组设置6个复孔，于培养箱中继续培养24 h。取出96孔板，弃去培养液，加入PBS液洗涤3次，然后每孔加入Hoechst 33258染液100 μL，37 ℃避光孵育30 min；孵育完成后，弃去孔内染液，PBS洗2次后，荧光显微镜下观察各组细胞的凋亡形态。

1.7 Western-blotting法检测相关蛋白表达 取药物干预完成后的各组细胞，加入1 mL RIPA液裂解20 min，提取细胞总蛋白，BCA试剂盒法测定细胞总蛋白含量。经12% SDS-PAGE凝胶电泳分离，转膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h后，加入稀释后的一抗(目的蛋白按1∶1 000稀释，内参GAPDH按1∶2 000稀释)，4 ℃孵育过夜。洗涤条带，加入IgG-HRP标记的山羊抗兔二抗(1∶1 000)室温下孵育4 h，洗涤，化学发光法显影。应用Image-Pro Plus软件分析条带灰度值，根据目的蛋白和内参蛋白对应灰度值的比值计算蛋白相对表达水平。

2 结果

2.1 巴戟天含药血清对MG63细胞增殖率的影响 结果如表1所示，以对照组细胞增殖率为100%，经不同浓度的巴戟天含药血清干预后，细胞增殖水平均受到不同程度的抑制。其中，24 h时中、高浓度组能明显抑制MG63细胞的增殖(P<0.01或P<0.05)，而48 h时各浓度组均能有效抑制MG63细胞增殖(P<0.01或P<0.05)，但同浓度下不同干预时间比较，仅有低浓度时48 h较24 h有统计学差异(P<0.05)。由此可见，巴戟天含药血清抑制MG63细胞增殖呈浓度依赖性，但并未见明显的时间依赖性。

表1巴戟天含药血清对MG63细胞增殖率的影响(%)

组别24 h48 h对照100100低浓度90.14±9.19 84.54±11.60*# 中浓度83.17±10.17*80.71±9.93* 高浓度70.28±8.75**67.88±10.30**

与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与24 h比较，#P<0.05。

2.2 巴戟天含药血清对MG63细胞凋亡率的影响 与对照组比较，中、高浓度的巴戟天含药血清均能显著增加MG63细胞凋亡(P<0.01)，其中，中浓度组平均凋亡率为15.48%，而高浓度组平均凋亡率达到24.31%。结果见图1、表2。

对照组 低浓度组 中浓度组 高浓度组图1 流式细胞术检测各组MG63细胞凋亡率

表2巴戟天含药血清对MG63细胞凋亡率的影响(%)

组别凋亡率对照6.74±0.46低浓度10.11±1.33中浓度 15.48±1.19**高浓度 24.31±2.08**

与对照组比较，**P<0.01。

2.3 巴戟天含药血清对MG63细胞凋亡形态的影响 如图2所示，对照组MG63细胞形态正常，分布较均匀，细胞荧光呈暗蓝色，无明显的凋亡特征；低浓度组细胞形态、分布及荧光颜色与对照组无明显差异；而中、高浓度组细胞数目减少，分布散乱，部分胞核碎裂，核固缩，细胞透亮，呈现典型的凋亡形态学特征，且高浓度组细胞凋亡形态更为明显。

对照组 低浓度组 中浓度组 高浓度组图2 Hoechst 33258荧光染色检测细胞凋亡形态(×100)

2.4 巴戟天含药血清对MG63细胞JNK通路的影响 与对照组比较，高浓度的巴戟天含药血清能显著增加MG63细胞JNK总蛋白及其磷酸化形式p-JNK蛋白的表达(P<0.01)，同时显著上调Bad磷酸化蛋白的表达水平(P<0.01)，但对Bad总蛋白的表达无明显影响；而通过检测凋亡执行蛋白Caspase-3的激活态Cleaved caspase-3发现，各浓度的巴戟天含药血清均能有效升高该蛋白的表达水平(P<0.01或P<0.05)，提示该药具有良好的促MG63细胞凋亡的效果。结果见图3，表3。

图3 Western-blotting法检测细胞JNK通路相关蛋白的表达

表3巴戟天含药血清对MG63细胞JNK通路相关蛋白表达的影响

组别 JNKp-JNKBadp-BadCleaved caspase-3对照 0.68±0.090.23±0.040.57±0.070.22±0.040.19±0.03低浓度0.67±0.140.29±0.040.59±0.060.31±0.030.37±0.05*中浓度0.74±0.090.53±0.07**0.62±0.080.39±0.03*0.42±0.04**高浓度0.81±0.10*0.89±0.13**0.64±0.060.54±0.05**0.82±0.09**

与对照组比较，*：P<0.05，**：P<0.01。

3 讨论

本实验MTT结果显示，巴戟天含药血清能有效抑制MG63细胞增殖，且呈明显的浓度依赖性，但在中、高浓度时，48 h干预结果对比24 h并无统计学差异，故认为不呈现时间依赖性，在后续研究中巴戟天含药血清干预时间依然选择24 h。

细胞凋亡在肿瘤治疗中一直非常受到重视，肿瘤细胞的无限生长与其凋亡受到抑制密切相关，凋亡障碍较大程度地影响着肿瘤的发生发展[5-6]。因而，有效拮抗凋亡抑制因子的作用，最大限度地选择性诱导肿瘤细胞凋亡而控制肿瘤生长，是肿瘤防治的关键。本研究采用流式细胞术和Hoechst 33258荧光染色法定性定量检测各组细胞的凋亡情况，发现巴戟天含药血清能明显诱导MG63细胞凋亡，导致细胞核碎裂、固缩、聚集，且呈一定的浓度依赖性，结果说明巴戟天具有良好的抑制骨肉瘤细胞生长的作用。

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是重要的胞内信号传导系统，负责将各种信号从细胞外传递到细胞核内部，调控着细胞新陈代谢、存活、分裂、凋亡等多种重要的生理过程[7]。JNK信号通路是MAPK家族主要成分之一，主要参与细胞存活、肿瘤形成、生长分化和细胞凋亡等生理过程[8]。JNK信号通路与肿瘤的发生发展密切相关，也是抗骨肉瘤药物筛选的关键靶点之一[9]。Bad是Bcl-2家族中促凋亡的关键成员，其功能主要由磷酸化状态的变化来调节，进而调控下游蛋白之间的相互作用和亚细胞定位[10]。细胞受到外界刺激后，JNK激活，苏氨酸183位点磷酸化增加，导致Bad蛋白丝氨酸128位点磷酸化，Bad活化，进而在线粒体完整性的基础上通过激活Caspase家族来调节细胞凋亡的发生[11-12]。本研究发现，巴戟天含药血清对JNK、Bad总蛋白有一定的调控作用，但并不明显，而对其磷酸化形式p-JNK、p-Bad作用显著，提示巴戟天诱导MG63细胞凋亡的作用与激活JNK、Bad蛋白有关。同时，在检测Caspase家族中最关键的凋亡执行蛋白Caspase-3的激活态Cleaved caspase-3发现，各个浓度的巴戟天含药血清均能有效增加Cleaved caspase-3蛋白的表达，其升高水平较p-JNK、p-Bad更为显著，可能是由于还受到其他凋亡通路的调控，由此推测JNK通路可能不是巴戟天诱导MG63细胞凋亡的唯一通路。

综上所述，本实验研究发现，巴戟天含药血清能促进人骨肉瘤MG63细胞凋亡，其机制与激活JNK信号通路，上调p-JNK、p-Bad和Cleaved caspase-3蛋白的表达有关。本研究明确了巴戟天含药血清诱导人骨肉瘤MG63细胞的作用及部分机制，为巴戟天抗骨肉癌的临床应用提供了重要的实验依据。但其存在更多的潜在作用机制，有待进一步深入研究。