体内外循环筛选法构建新型的胰腺癌吉西他滨耐药模型

严秋亮 陈燕 叶清煌 刘栋 张凯 朱锦辉⋆

胰腺癌是病死率较高的恶性肿瘤，化疗效果不理想。作为治疗胰腺癌的首选药物吉西他滨，其化疗有效率也仅25%［1］，多药耐药是导致化疗效果欠佳的重要原因。目前国内外对于胰腺癌吉西他滨耐药细胞系建立多采用体外细胞培养的方式［2］。但这些模型不能真实反映临床上胰腺癌耐药多通过体内药物诱导逐步产生的实际现象，构建更符合胰腺癌吉西他滨耐药发生发展过程的模型有助于获得更科学的实验结果。2015年5月至2017年5月作者通过实验研究，使筛选的耐药细胞株及构建的耐药模型更能模拟临床胰腺癌吉西他滨耐药的过程，区别于细胞株化疗药物单纯体外阶梯浓度诱导获得耐药细胞株，在体内环境下具有更好的稳定性。现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 （1）实验动物：30只雄性BALB/c裸小鼠由浙江中医药大学动物实验中心提供，鼠龄41～57d，平均（47±12）d。质量 18～20g，平均（19.2±0.7）g，饲养于恒温25～27℃、恒湿45%～50%，且符合无特定病原体条件的裸鼠室内，饮用水及标准食疗均经灭菌后供动物自由食用。（2）细胞株： PANC-1由浙江大学医学院附属第二医院外科研究所提供。PANC-1/R2为体外培养体内诱导循环筛选的新方法获得的PANC-1的吉西他滨耐药株（由上海黄离生物技术有限公司提供）。（3）主要仪器和试剂：实时定量基因扩增（qPCR）仪购自Biorad公司，IS1000凝胶成像系统购自美国法莫西亚公司，Beckman Coul ter Avanti J-20低温离心机购自德国Heraeus公司，Taq DNA聚合酶购自日本Takara公司，注射用盐酸吉西他滨（健择）（LILLY公司，批号A283463）；微卫星位点分别为D14S68 、D18S69 、D20S199，引物序列检索自NCBI的UniSTS数据库，由上海生工生物工程公司合成。

1.2 方法 （1）分组方法：将30只裸小鼠随机分成2组，每组各15只，分别用于第一轮循坏和第二轮循环。第一轮循环：PANC-1细胞株皮下移植再原位移植的方法建模，将9×106细胞悬液接种至裸鼠的右侧颈背部皮下，待长成1cm3大小后将实体瘤取出，剪切成lmm3大小的瘤块。20g/L戊巴比妥钠溶液45mg/kg腹腔注射麻醉裸鼠，上腹部2cm切口，剪开胰腺被膜，将1mm3大小的瘤块植入胰尾近脾门处。每周称重，于35d处死。胰腺癌裸鼠胰腺原位移植后7d开始，注射用盐酸吉西他滨240mg/kg，1次/周腹腔注射，共4次，第35天处死。收集裸鼠肿瘤病灶及淋巴结和内脏等标本组织，将腹腔化疗后瘤体最大的5个模型的瘤体组织，酶消化法进行瘤体源性原代细胞培养。第二轮循环，实验方法同第一轮循环，即皮下成瘤，腹腔原位移植，腹腔化疗，获得瘤体组织，细胞分离培养等。收集两组裸鼠肿瘤病灶及淋巴结和内脏等标本组织。记录两组裸鼠重量、肿瘤组织重量，及胰腺外淋巴、远处转移发生率，并行组间比较。（2）耐药细胞亚群的遗传背景鉴定：抽提模型动物胰腺组织（液氮冻存）、PANC-1/R2和亲代细胞PANC-1的DNA，以其为模板，PCR法扩增三个微卫星序列，PCR产物聚丙稀酞胺凝胶电泳和银染显色。具体如下，PCR扩增：10μl反应体系中含有样本 DNA约0.1μg，引物各5pmol，TaqDNA聚合酶0.3μl等。反应条件：预变性94℃2 min；循环94℃×30s、5 6℃×30s、72℃×30s，共36个循环；延伸56℃ 5min；显示：PCR产物大小分别为 148～172bp、192～210 bp、108～126 bp，8%聚丙稀酰氨凝胶电泳和银染显色显示。

1.3 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。计量资料以（）表示，多组比较用方差分析，组间两两比较用 Student-Newman-keuls法，相关分析采用Spearman等级相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两轮循环一般资料比较 见表1。

表1 两轮循环一般资料比较（）

表1 两轮循环一般资料比较（）

第一循环 第二循环 P值成功率［n（%）］ 11（73） 12（80） ＞0.05死亡率［n（%）］ 2（18.2） 1（8.3） ＞0.05最大五瘤体大小（g） 1.76±0.87 2.16±1.12 ＜0.05转移率 1（11.1） 4（36.3） ＜0.05

2.2 不同浓度吉西他滨作用下PANC-1和PANC-1/R2细胞抑制率及瘤体重量 见表2。

表2 不同浓度吉西他滨作用下PANC-1和PANC-1/R2细胞抑制率及瘤体重量

2.3 PANC-1/R2和PANC-1细胞的遗传学背景 人类基因组微卫星D14S68、D18S69、D20S199检测结果显示，亲代胰腺癌细胞、吉西他滨耐药胰腺癌细胞三个位点微卫星扩增大小完全相同的片段，而荷瘤裸鼠胰腺组织未扩增出相应的带型（见图1）。

3 讨论

图1 a、b、c分别为D14S68、D18S69、D20S199序列PCR产物聚丙稀酞胺电泳银染结果。最左边泳道DNAmarker，1、2、3道分别代表从裸小鼠胰腺、亲代细胞PANC-1、吉西他滨耐药细胞PANC-1/R2中扩增产物。可见第2、3泳道扩增产物完全一致，第1泳道未扩增相应的条带

构建相应动物及细胞模型是研究肿瘤发生发展重要的部分，建立具有明确特征的肿瘤模型是研究和揭示肿瘤分子机制的关键平台。胰腺癌恶性程度高，术后复发及转移率高，化疗药物作用效果差异大，胰腺癌的治疗效果欠佳。肿瘤对化疗药物的耐药是降低胰腺癌治疗效果的重要原因之一。构建模拟肿瘤生物学特征的动物模型是肿瘤学研究的重要步骤。国内外的学者构建了多种胰腺癌模型：通过瘤块移植构建胰腺癌模型，原位移植法构建淋巴转移模型，腹腔注射构建胰腺癌腹膜转移模型等［3］。本研究显示，在移植瘤移植5周后，移植成功率达73.3%～80%，转移率达到11.1%～37%，具有制模时间短、成瘤率高、转移率高的特点。与其他胰腺癌动物模型比较，其生物学行为与人类胰腺癌极为接近，模拟同原发肿瘤发病部位相似的肿瘤微环境（胰腺体尾部肿瘤），能在相应部位形成转移灶，避免因移植位点特异性引起的假阳性，对胰腺癌的自然病程进行模拟，可以认为是一较理想的“拟人”胰腺癌转移模型［4］。该模型的主要缺点在于手术技术要求较高，且裸鼠耐受能力较差，操作过程有一定的死亡率，本资料达8.3%～18.3%，故在制模时要求较高的实验条件及操作技术。

对于耐药细胞系的建立，目前所采用的几乎均是体外培养，药物阶梯浓度诱导驯化的方法。具体到培养手段，可以是培养液中加入药物，也可以是培养基中加入药物。该方法原理简单，但不易掌握，失败率高。最重要的是不能充分模拟临床上化疗药物多药耐药产生的实际过程［5］。以其为研究平台获得的结果有时无法反映人体复杂的多因素作用过程。因此，本研究设计了全新的胰腺癌吉西他滨耐药细胞及动物模型，即体外培养-体内诱导循环筛选法构建胰腺癌吉西他滨耐药细胞及动物模型。该方法充分模拟人体胰腺癌产生吉西他滨耐药的过程，本资料仅循环筛选2轮，其耐药特征已较明显，理论上再循环数次其耐药特征将更显著。

经过2轮的筛选，获得胰腺癌吉西他滨的耐药细胞，命名为PANC-1/R2。按此方法，若经后增加循环次数（m），其命名方法即为PANC-1/Rm。该方法易于标记，也能明确筛选和循环次数。评价筛选的耐药细胞株，体内及体外的耐药实验是必不可少的［6］。本研究测定了三种不同吉西他滨浓度作用下，亲代细胞PANC-1和耐药细胞系PANC-1/R2的抑制率，分别是21.8%、37.1%、46.1%和12.6%、25.3%、36.8%， 耐药细胞系PANC-1/R2的抑制率均明显小于亲代，可见其抗吉西他滨作用明显强于亲代细胞，表现出明显的耐药性。而用PANC-1和PANC-1/R2分别构建胰腺癌动物模型，吉西他滨腹腔注射治疗后，获取瘤体，PANC-1/R2瘤体重量为（2.19±0.71）g，明显高于PANC-1的（1.87±0.69）g。这种通过体内外的耐药实验可以直观的明确细胞的耐药性，较通过测定耐药相关基因表达ABCG2、ABCB1 和 PLK1等更简便而确切。

通过这种循环筛选的方法，筛选的次数越多，肿瘤细胞出现变异及遗传变异的机会增多。特别在免疫缺陷的实验动物中进行人类肿瘤移植实验可能诱发宿主自发瘤，为此，必须证明筛选的亚群细胞与亲代细胞是否具有一致的遗传背景，即遗传同源性。本实验从亲代与传代细胞和实验动物胰腺组织中扩增人类特异的 D14S68、D18S69、D20S199三个微卫星序列［7］，结果显示，亲代与耐药亚群细胞3个微卫星位点扩增产物片段完全相同，而裸小鼠正常胰腺未扩增出相应的产物片段，这既证实耐药瘤体完全来源于原肿瘤模型，也表明该移植模型经过体内连续传代，仍保留其遗传稳定性。本次实验成功筛选和分离吉西他滨耐药特征的胰腺癌细胞，为胰腺癌耐药实验研究提供了一个良好的实验工具。通过比较这种亚群细胞和亲代细胞的基因表达差异网，可以获得胰腺癌的化疗药物耐药相关分子表达谱，有利于推动胰腺癌耐药的分子机制研究，并为胰腺癌化疗增敏提高预后和干预提供可能的靶分子。