一例猪水肿病和猪链球菌病混合感染的诊断报告

刘守川，刘 杰，王志红，薛 瑞，王洋洋，肖亚朋

（洛阳中科基因检测诊断中心有限公司，河南 洛阳 471000）

2018年5月洛阳某猪场保育猪出现咳嗽，喘气、关节肿大等症状，部分猪有下颌、眼脸肿大的现象。对1头发病猪进行剖检，取病变组织进行病原学鉴定，结果检测出溶血性大肠杆菌、猪链球菌。结合临床症状、病理变化和实验室诊断，确诊为猪水肿病和猪链球菌病混合感染。

1 材料与方法

1.1 临床情况及取样

图1 剖检图片

某猪场保育猪出现咳嗽、腹式呼吸、关节肿大、下颌和眼脸肿大等症状，发病率40%，死亡率30%。选取1头有下颌、眼脸肿大、腹式呼吸并伴跛行等症状的病猪进行剖检。剖检可见心包积液增多、呈淡的清色，肺脏边缘有黄色纤维素性渗出物，肺间质增宽，肾脏肿大，肠道水肿。根据临床症状及病理情况分别采集肺脏等组织进行细菌分离。

1.2 主要培养基及试剂

胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）、革兰氏染色试剂、DNA Taq酶、dNTPs、DNAmarker、细菌微量生化管及药敏纸片。

1.3 方法

1．3．1 细菌分离

无菌采取病死猪肺脏，分别接于血平板和TSA+血清+NAD培养基，37 ℃，厌氧培养24 h，观察菌落形态，挑取单个菌落进行纯化培养，纯化培养后菌株进行革兰氏染色镜检和常规细菌生化试验。

1．3．2 生化鉴定

选取生化鉴定试管进行实验。

1．3．3 16S rDNA 克隆测序及序列分析

挑取单个菌落进行16S rDNA测序分析，引物为实验室常用引物：16S-F1500：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’，16S-R1500：5’-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT，扩增出的目的片段大小约为1 500 bp，该引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。

PCR采 用50μL反 应 体系， 即 10×PCR Buffer 5．0μL、dNTP4．0μL、DNA Taq 酶 1．0μL，16S-F1500/16S-R1500 引 物 各 2．0μL，DNA 模 板 4．0μL，ddH2O 32．0μL。PCR反 应 条 件 为：95 ℃ 5 min，94 ℃ 60 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s， 共 30 个 循 环；72 ℃10 min。取部分 PCR 产物经 1．5% 琼脂糖凝胶电泳鉴定，剩余产物送北京英潍捷基公司测序，并用MEG7．0进行序列分析。

1．3．4 药敏试验

挑取疑似单个菌落接种于TSB+血清培养基，置于37 ℃恒温摇床中，培养5～6 h，取100μL均匀涂布于含血清的MH培养基上。用纸片琼脂扩散法（K-B法）[1]进行药敏试验，选取头孢噻呋、阿莫西林、甲砜霉素、硫酸黏菌素、杆菌肽、阿米卡星、恩诺沙星、卡那霉素、庆大霉素、多西环素和氟苯尼考为试验药物，37 ℃培养16～18 h后，记录各药敏纸片的抑菌圈直径大小，根据说明书敏感和耐药性的最小抑菌圈直径判定菌株对所选药物的敏感程度。

2 结果

2.1 细菌分离结果

细菌初次分离时平板上有两种菌落形态，分别命名为20180630和20180725，挑取单个菌落进行纯化后，在血平板上，20180630为小而透明菌落，β溶血，革兰氏染色阳性球菌，呈链状，如图2和图3；20180725为灰色大菌落，β溶血，呈黏液状，革兰氏染色阴性杆菌，如图4和图5。

2.2 细菌 16S rDNA 鉴定结果

利 用 16S rDNA 检 测 引 物 扩 增出大小为1．5 kb左右的目的片段，如图6。对测序结果用DNA STAR软件处理，并与NCBI中已发表的16S rRNA基因序列进行同源性比较，选取同源性最高菌株的16S rRNA基 因 序 列， 采 用 MEG7．0软 件 进行多重序列比对分析，并构建系统进化树，如图7，从结果可以看出，20180630 与 streptococcus suis S735同 源 性 为 99．65%， 证 明 该菌 为 猪 链 球 菌。20180725与Escherichia coli ATCC 11775 同源性为99．36%，证明该菌为大肠杆菌。

2.3 生化鉴定结果

从 表1和 表2不 难 看 出 ，201807630发酵乳糖、菊糖、棉子糖、海藻糖和水杨苷，不发酵七叶苷、甘露醇和山梨醇；20180725发酵棉子糖、蜜二糖、甘露醇，对山梨醇、肌醇，吲哚、VP、苯丙氨酸、柠檬酸盐、硫化氢呈阴性，产生尿素酶，不产生鸟氨酸脱羧酶和赖氨酸脱羧酶，能运动。

图2 20180630菌落形态

图3 20180630革兰氏染色镜检（1 000×）

2.4 药敏试验结果

挑取分离到的20180630和20180725进行药敏试验，20180630敏感药物为头孢噻呋、阿莫西林、甲砜霉素、杆菌肽、恩诺沙星、氟苯尼考；20180725敏感药物为硫酸黏菌素和阿米卡星。

3 总结

本次检测结果为大肠杆菌和猪链球菌混合感染，从临床症状和分离到的细菌的致病机理判断，此次应该是猪链球菌继发大肠杆菌感染，分离到的猪链球菌在后续实验室鉴定中排除2型猪链球菌的可能。猪链球菌产生透明质酸酶造成血管中纤维蛋白渗出，附着于脏器表面。猪链球菌的感染造成动物机体抵抗力下降，引起大肠杆菌感染[2]。

临床上能引起猪纤维素性渗出症状的细菌病有很多，常见的有猪肺疫、传

图4 20180725菌落形态

图5 20180725革兰氏染色镜检（1 000×）

图6 细菌16S rDNA扩增结果

图7 16S rDNA基因全序列系统发育树

表 1 20180630 生化鉴定结果

表 2 20180725 生化鉴定结果

表 3 20180630 药敏试验结果

说明：S为敏感，R为耐药，I为中介。下表同。染性胸膜肺炎放线杆菌病、副猪嗜血杆菌病和猪链球菌病等[3]，需要对其进行简单了解以便进行快速区分，并且有助于实验室细菌分离。本次临床症状主要表现为纤维素性渗出，关节肿，肺部有病变，传染性胸膜肺炎放线杆菌和猪肺疫一般很少能引起关节肿的临床症状，另外传染性胸膜肺炎放线杆菌纤维素性渗出主要集中在胸腔，副猪嗜血杆菌虽然引起纤维素性渗出和关节肿，但是副猪嗜血杆菌病一般在肺部组织很少有病变出现，表现的都较为健康[4]。

表 4 20180725 药敏试验结果

能够引起动物发病的大肠杆菌，世界上公认的有5种，分为不同的血清型，分别为肠致病性大肠杆菌（EPEC）、产肠毒素性大肠杆菌（ETEC）、肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）、肠出血性大肠杆菌（EHEC）、肠聚集黏附性大肠杆菌（EAEC）[5]，本次分离的溶血性大肠杆菌与ATCC 11775的同源性为99．36%，ATCC 11735为致病性大肠杆菌（EPEC），但是在实际临床情况中猪群并未表现出大规模的水肿症状，所以水肿病可能为个例，但在实际用药过程中仍需要防范大肠杆菌病的暴发。因为大肠杆菌是环境中或动物机体常见菌群，所以在临床分离细菌时容易忽略大肠杆菌，尤其是实验室人员在不知道临床症状的情况下，容易忽略大肠杆菌作为致病因素的情况，所以在实验室细菌分离后需要与临床症状进行印证，防止出现实验室病原与临床症状不一致的情况出现。本次分离到的大肠杆菌表现出较强的耐药性，在实际用药过程中应注意抗生素的使用方式。

药敏结果对所分离的两种细菌有不同的表现，实际用药建议使用头孢噻呋和阿莫西林。阿米卡星使用时，应注意猪群情况，防止加重临床症状，根据本次细菌分离情况，病原主要是细菌病，在使用抗生素的过程中，需要添加黄芪多糖[6]，防止阴性杆菌释放内毒素造成动物应激死亡。根据实验室提供的建议，养殖场在使用头孢噻呋和阿莫西林后，临床症状明显减轻。