原发性肝癌生物标志物与中医微观辨证学创新和发展

冯文杏，周小舟，张卫，韩志毅，孙新锋，马文峰

(广州中医药大学第四临床医学院，广东 深圳 518033)

原发性肝癌是危及人们生命健康的一大问题，常见的是肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)，发病率占90%[1]，其次是肝内胆管细胞癌(Intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC)。HCC是世界第六大常见恶性肿瘤和第四位癌症相关死亡原因[2]。我国每年因HCC死亡的人数约38.3万人，占全球HCC死亡人数的51%[3]。病毒性肝炎、脂肪性肝炎、过度饮酒、黄曲霉素等均与肝癌的发生相关，所以肿瘤发展过程中存在各种病原因素、肿瘤异质性等，宏观和微观存在一定差异。HCC起病隐匿，很多患者诊断时已是晚期，仅1/3的新确诊患者适合于治愈性治疗，故预后较差。

随着技术的进步和对HCC生物学的理解增加，不断有新的标志物被发现。提高对血清和组织标志物的认识可以对这一致死性疾病的早期诊断和早期的诊疗策略产生积极的影响。由于其非侵入性、目的性及能反复评估的潜力，血清标志物可以成为更有潜力监测和早期诊断HCC的工具，到目前为止，许多生物标志物已被推荐用于HCC诊断。中医药对HCC的治疗具有较好的疗效，但目前现代医学和中医药都尚未发现有效的药物作用靶标。运用宏观辨证思维虽可洞察病机，但由于不同病原因素对HCC的致病影响不同，可导致临床症状表现不同、治疗效果不尽相同，显示异质性，即存在微观差异。

1 HCC诊断、预后和预测的组织标志物

内皮细胞标志CD34和抗平滑肌抗体(SMA)阳性，提示广泛的新血管化过程和肝窦毛细血管化。三种特异性免疫标志物过度表达(Glypican-3，GPC3；HSP70;Glutamine synthetase-GS)已被认为是小的和早期HCC选择性标志物[4]。P21激活酶5(PAK5)可能成为HCC有利的诊断/预后标志[5]。内皮细胞特异性标志如CD31、CD34或von Willebrand因子有显著的预后潜能；血管生长因子(VEGF)和其他调节因子高表达与总体生存率(OS)、自由生存复发和切除后早期复发相关；上皮细胞间质化(EMT)，可获得不受限制的运动性和远处转移的潜力[6];60%HCC p53基因失去活性[7];选择性抑制VEGF途经已集中于HCC分子治疗领域的靶向研究，尤其是索拉菲尼，一种持续的Raf/Map酶抑制剂。

2 HCC血清标志物及基因组学时代

因低敏感性和低的特异性，对甲胎蛋白(AFP)作为监测性的检测指标已渐渐引起争议。日本的研究结果提示,在AFP水平低和US无可疑发现时，甲胎蛋白异质体-3(AFP-L3)升高是HCC形成的早期预测因子；AFP-L3%阳性的患者能更早形成血管侵犯和肝内转移，AFP-L3%被考虑作为HCC侵袭性标志[8]；异常凝血酶原(Des-r-Carboxy Prothrombin，DCP)参与肿瘤血管形成，增加血管生成因子如VEGF-R、VEGF和MMP-2基因表达，Meta分析提示DCP在HCC中有中等的准确性[9]；研究显示，在VEGF中单个核苷酸多态性(SNPs)是HCC切除患者生存预测因子[10]；p53基因突变在HCC早期无变化，主要在HCC晚期血管形成时才有变化，这就限制了其在诊断中的作用。TGF-b1 mRNA血清水平在HCC患者中升高，并且与肝癌形成和肿瘤血管形成相关；miRNA在HCC细胞中不同的表达提示其在预测HCC预后的潜在价值。本课题组建立了X基因阳性与阴性的HepG2细胞，用 ELISAs法对深圳和美国韩国移民HBV未感染者、HBV和HCV相关的慢性肝病及HCC患者进行癌相关抗体研究。发现,抗URG11和URG19多见于HBV相关HCC患者中，而抗URG7，DRG2多见于HBV相关没有发生HCC患者中；另外，在发生HCC之前有4个或更多抗体被检测出[11-13]。

应用高通量测序技术寻找肝癌新的标记物的研究层出不穷。DNA异常甲基化在肝癌细胞中被发现，Zhang等[14]利用焦磷酸测序技术发现在肝癌肿瘤细胞中平均甲基化水平要比癌旁细胞更低；Wu等[15]认为白细胞中整体DNA甲基化水平可以作为肝癌风险诊断标记物；另外在肝癌患者游离的DNA中也发现了高度甲基化CpG岛[16]。在转录物组水平上通过深度测序发现一种新的带有编码区域的基因DUNQU1，在HCV呈阳性中特异性表达，而且FGFR2的可变剪接与病毒感染、肿瘤大小和复发等相关[17]；研究发现HBV相关HCC患者甲基化前五的DNA是DAB2IP、BMP4、ZFP41、SPDY1和CDKN2A,去甲基化的前五个DNA是CCL20、ATK3、SCGB1D1、WFDC6和PAX4[18]。

MicroRNA(miRNA)可调节细胞增殖、分化、凋亡等。已经发现mRNA异常增殖表达与肝癌的发生发展有关，最有可能成为HCC早期诊断的标志物[19-20]；Hou等[21]通过对肝癌miRNA组的分析发现,miR-199a/b-3p在肝癌中显著下调；Law等[22]对肝癌miRNA转录物组进行研究揭示了miR-1323在肝癌中的高表达；在关于HBV相关HCC患者的队列研究中发现，女性的miR-26a和miR-26b表达高于男性，miR-26a和miR-26b低表达与短期生存相关。另外一些研究认为长链非编码RNAs(long noncoding RNAs，lncRNAs)对HCC诊断和预后是一种新的标志物；具有调节蛋白、RNA活性、转录、蛋白转运和细胞代谢的作用，众多研究证明了lncRNAs在HCC的形成、发展和预后作用[23-25]。

3 肝癌微观辨证学研究及HCC气血辨证创新和发展

微观辨证学崛起于20世纪80年代，是一门介乎基础与临床学科之间主体学科[26]，秉持“司外揣内”的中医思想，认为疾病的证候是在一定病因刺激下发生发展而成，其中的病因刺激一方面可以理解为传统的风、寒、暑、湿、燥、火等邪气或病理产物，亦可以更深入细化到神经、免疫、代谢等环节，微观辨证即从这个角度触发，意在探寻宏观证候下的微观规律，打破了传统辨证的思维局限。肝癌的发生是一个复杂过程，是多环节、多因素的，运用多学科交叉，能为肝癌辨证分型提供生物学依据[27]。费凤英等[28]发现TM三项联检联，即AFP、AFP-L3和 α-L-岩藻糖苷酶(AFU)，可提高AFP阴性肝癌诊断率，或对肝癌辨证诊断有价值；张红等[29]发现肝癌不同证型中AFP、CEA存在差异；黄争荣等[30]应用SEIDI-T0F-MS筛选出2个可鉴别肝郁气滞型与肝胆湿热型肝癌患者的差异蛋白质；李梦萍等[31]研究发现，不同证型肝癌患者肝组织某些miRNA水平有差异，其中miR-122-3P明显高于正常组，气虚血瘀组最明显。这些研究对肝癌的辨证诊断从传统的象、证等深入到血清标志物、蛋白质水平甚至基因表达层次，是中医宏观与微观联系的探索，亦是尝试对难以把握的宏观辨证一个客观量化。

气血辨证是中医辨证的方法之一，在脏腑经络学说的基础上，从气血的角度分析疾病证候。“善言气者，必彰于物”“气”与“物”是相互维系的，微小物质的变化或可反映气血的变化，揭示规律，在这一想法启示下，导师周小舟教授首创了HCC气血微观辨证学。自90年代以来，导师运用中医、中西医结合研究对HCC气血微观辨证诊断和治疗进行了一系列探索，初步发现不同证型之间存在血清肿瘤标志物等微观差异。研究比较69例气虚血瘀证和74例气滞血瘀证HCC患者病原因素、临床表现和病理类型发现：年龄小于50岁患者占比、疼痛症状、病理分型为弥漫型和巨块型肝癌及AFP 20～200 ng/mL阳性率，后者明显高于前者；吸烟、HBsAg阳性占比，伴有肝硬化、病理类型为单个小结节型、TNM分期IV 期及AFP>400 ng/mL阳性率，前者明显高于后者。研究结果提示：年龄、吸烟、HBsAg阳性、肝硬化、病理类型等因素可能是形成不同证型的微观基础[32]；采用抗癌方联合TACE治疗64例气虚血瘀型原发性肝癌患者临床显示，患者的血清AFP水平改善、1年生存率、中医临床证候改善等均高于对照组[33]。此外，导师也探索了金属离子、免疫细胞等与肝癌证型之间的关系[34-36]。中医经典的辨证论治以宏观的象为把握点，这一系列对微观的研究将推进对不同疾病证候发生发展的规律的了解，是对宏观“气血辨证”的补充。

4 结语

肿瘤异质性在HCC中是广泛存在的，有复杂的基因突变背景。对血清和组织标志物的探索和研究最终将导致这一致死性疾病的早期诊断和较好的早期治病策略。经典的病理学和特征指标仅仅部分能够检测个体肿瘤的临床行为(特征)，新的分子检测和方法将不得不加入到以形态学为基础的诊断过程中。在科学发展的契机下，多学科交叉有利于与对这一疾病的早期诊断、预防和预后预测，这种综合模式与中医辨证论治思想在某些方面有相同之处，或可为中医对疾病整体观与微观辨证之间的关系架起研究的桥梁，从而发展建立客观可行的中医辨证模式，亦是中医传承和创新发展的重要手段。为中医诊断体系的建立、特别是为未来HCC中医药定靶治疗带来希望。