蛇床子素体外对酵母相马尔尼菲篮状菌的抗菌活性检测

罗秋红 潘开素 罗宏 曹存巍

1广西中医药大学第一附属医院皮肤科，南宁 530023；2广西医科大学第一附属医院皮肤科，南宁 530021

马尔尼菲篮状菌（Talaromyces marneffei，TM）为双相真菌，在25℃呈菌丝相，37℃致病状态时为酵母相。TM感染引起的马尔尼菲篮状菌病是一种凶险的极易死亡的系统性真菌病，在广西有区域性流行［1］。马尔尼菲篮状菌病进展快，若不及时治疗，病死率可高达91.3%［2］。由于两性霉素B等常用抗真菌药治疗马尔尼菲篮状菌病不良反应多，患者不耐受且易复发［3］，寻找有效低毒的抗真菌药是控制病情的关键。研究显示，蛇床子对新型隐球菌、镰刀菌、白念珠菌、曲霉等临床分离的9种病原真菌有抑制作用［4］。然而，迄今国内外未见蛇床子对TM抗菌活性的研究报道。蛇床子素是蛇床子的主要成分［5］，我们以蛇床子素对TM进行药敏实验，为蛇床子治疗马尔尼菲篮状菌病提供实验依据。

一、材料与方法

（一）菌株来源：马尔尼菲篮状菌20株，其中1株为标准株FRR2161，由澳大利亚墨尔本大学Alex Andronopolous教授惠赠；11株为临床患者分离株（2015—2017年于广西医科大学第一附属医院分离），编号为1～11；6株为野生竹鼠分离株，编号为12～17，临床分离株及野生株均系北京大学真菌和真菌病研究中心保存菌株。2株氟康唑天然耐药株A1、A3，为广西医科大学真菌实验室保存菌株［6］。所有菌株均经形态学和分子生物学鉴定。近平滑念珠菌ATCC22019为质控株。

（二）药物来源：蛇床子素（人工合成）、氟康唑、两性霉素B（AmB）、伊曲康唑、伏立康唑原粉均来自美国Sigma公司，纯度均为98%，等级为二级。其中氟康唑溶解于高压灭菌水中，配成1 280 mg/L储存液；AmB、伊曲康唑、伏立康唑溶解在100%二甲基亚砜中，获得的储存液浓度均为1 600 mg/L；蛇床子素溶解于二甲基亚砜，配成12 800 mg/L储存液。所有药物储存液-20℃保存备用。实验前用RPMI 1640液体培养基将药物稀释至2倍终浓度工作液。

（三）方法：

1.菌悬液制备：实验前将TM受试菌接种在脑心浸液琼脂培养基上，37℃培养，每7天传代1次，传3代。取1 ml灭菌水加入试管内，轻抽吸后，将菌悬液吸至无菌试管中静置10～15 min，取上清液振荡15 s，用比浊仪（法国生物梅里埃公司）调整菌悬液浓度至（1～5）×106菌落形成单位（CFU）/ml，再用RPMI 1640液体培养基稀释至（1～5）×103CFU/ml。

2.药敏板制备：向96孔细胞培养板各孔加入2倍终浓度药液100 μl。第1～10列各孔药物浓度范围：氟康唑0.125～64 mg/L（A1、A3为氟康唑天然耐药株，药物浓度范围1～512 mg/L），AmB 0.125～64 mg/L。伊曲康唑、伏立康唑浓度范围参考文献［7］定为0.002～1.024 mg/L。蛇床子素为2～1 024 mg/L。取100 μl（不含药液）RPMI 1640液体培养基加入第11列各孔中作为TM生长对照（阳性对照）；取200 μl RPMI 1640液体培养基加入第12列各孔中，不接种TM，作为阴性对照。配制好的药敏板存放在-20℃备用。

3.液体培养基的接种：在96孔培养板上除第12列阴性对照孔外，其余各孔均加入（1～5）×103CFU/ml菌液100 μl，37℃下培养48 h观察结果，每株实验菌株均重复3次实验，结果取中位值。每次实验均使用ATCC22019近平滑念珠菌进行质控。

4.最低抑菌浓度（MIC）结果判定：用视觉法判定终点，参照美国临床实验室标准研究所颁布的酵母菌抗真菌药物敏感性实验方案M27-A2进行判定［8］。与生长对照孔相比，≥80%生长抑制所对应的最低药物浓度为氟康唑的MIC；两性霉素B、伊曲康唑、伏立康唑、蛇床子素MIC定义为100%生长抑制所对应的最低药物浓度。MIC50及MIC90分别为能抑制50%或90%受试菌所需的最低药物浓度。

二、结果

质控株MIC值均在参考范围内，生长对照孔中真菌生长良好。各药物的MIC值范围：氟康唑2.0～8.0 mg/L（氟康唑天然耐药株为128 mg/L），AmB 1.0～4.0 mg/L，伊曲康唑0.03～0.25 mg/L，伏立康唑0.06～0.25 mg/L。11号临床株对AmB耐药（MIC值为4.0 mg/L），其余菌株均对AmB敏感。所有菌株对伊曲康唑及伏立康唑均敏感。蛇床子素对标准株FRR2161的MIC为16 mg/L，对氟康唑天然耐药株的MIC均为32 mg/L，对11号菌株MIC为32 mg/L，对第16号菌株MIC为128 mg/L，对其余16株TM的MIC值范围为16～64 mg/L，MIC90以及MIC50分别为64和32 mg/L。

三、讨论

蛇床子为伞形科一年生草本植物蛇床的干燥成熟果实，具有温肾壮阳、祛风燥湿、止痒的功效。蛇床子的有效成分主要集中在香豆素，而蛇床子素约占总香豆素的60%，含量最高［5］。蛇床子素对真菌有杀灭和抑制作用［9-10］。李晶红等［11］发现，蛇床子乙醇提取物对白念珠菌的MIC为0.312 5～2.5 g/L，蛇床子提取物对受试菌种（包括白念珠菌、乳杆菌等）的平均MIC值为2.5 g/L。于军等［4］应用粉碎机对中药蛇床子进行粉碎，超声波提取，循环水式过滤，回流浓缩，应用试管法检测蛇床子对新型隐球菌、镰刀菌、白念珠菌、曲霉等临床分离的9种致病真菌的作用，发现蛇床子的MIC均为25 g/L。王丽纳等［12］研究认为，蛇床子乙醇提取液可以通过抑制Hsp60和Hsp90的表达抑制红色毛癣菌增殖，且这种抑制呈浓度依赖性，其对红色毛癣菌的MIC值为6.64 g/L。以上研究多采用蛇床子乙醇提取液或者水提液，测得MIC数值较高。联合药敏实验研究显示，氟康唑与蛇床子素联合体外对耐氟康唑的白念珠菌具有协同抗菌作用［13］。本研究中几种常用抗真菌药物氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑对TM的MIC与既往文献报道相似［14-16］。本研究中大部分菌株对AmB敏感（MIC值范围1.0～2.0 mg/L），仅有11号菌株对AmB耐药（MIC值为4 mg/L，MIC值＞2.0 mg/L被认为耐药［15］），而蛇床子素对11号菌株MIC为32 mg/L，提示对AmB耐药的马尔尼菲篮状菌病可以尝试用蛇床子素治疗。本研究中蛇床子素对第16号菌株MIC值为128 mg/L，数值相对增高，其原因仍有待进一步研究。蛇床子素对氟康唑天然耐药株（A1、A3）的MIC均为32 mg/L，与蛇床子素的MIC50一致，其结果远远小于氟康唑对A1、A3的MIC 128 mg/L，提示蛇床子素对氟康唑天然耐药株依然有抑制作用。蛇床子素对其他TM菌株以及FRR2161的MIC值范围为16～64 mg/L，MIC90以及MIC50分别为64和32 mg/L，与既往蛇床子对真菌的活性实验的结果［4，10-12］比较，蛇床子素的MIC数值较小，抗TM敏感性高，提示蛇床子抗TM活性主要集中在单体蛇床子素。

总之，本实验以蛇床子素对酵母相TM进行体外药敏实验，发现蛇床子素对酵母相马尔尼菲篮状菌有较强的抑制活性，氟康唑天然耐药株以及两性霉素B耐药株也对蛇床子素敏感，该结果将为今后从中医药方面治疗马尔尼菲篮状菌病提供理论依据。蛇床子中除蛇床子素之外的其他单体如佛手柑内酯、异虎耳草素等［5］是否对TM也有抑制作用，尚需进一步研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突