中华蜜蜂保种（资源）分子生物学评价方法

陈道印 苏晓玲 赵东绪 华启云

（金华市农业科学研究院）

1 蜜蜂保种重要性

蜜蜂对于自然界以及人类社会来说，是一种具有巨大价值的社会性昆虫。蜜蜂是自然界重要的授粉昆虫，具有巨大的生态价值，在世界上已知的16万种虫媒植物中，蜂媒植物占85%[1]。对于人类社会来说，蜜蜂授粉已经在农业生产中发挥出显著的社会效益和经济价值，联合国粮农组织（FAO）的调查结果表明，蜜蜂对世界各个地区的农业生产都有显著的促进作用[2]。而蜜蜂生产的蜂蜜、蜂花粉等蜂产品，除了能够提高人民的生活质量外，还能为蜂农带来可观的经济效益。

目前世界上人类饲养最多并且分布最广的是东方蜜蜂（Apis cerana）和西方蜜蜂（Apis mellifera），它们是蜜蜂属中的两个不同的蜂种，在人为干预以及自然选择的作用下又形成了许多不同的种质资源。但目前在世界范围内，某一些品种因其优良的经济性状被盲目地引种，造成原有地方品种种群数量大大减少，这严重威胁了蜜蜂整体的种质资源状况。

分布于我国境内的中华蜜蜂（Apis cerana cerana）是适应于我国独特森林生态系统的本土蜂种[3]。中华蜜蜂在长期的自然选择过程中形成了具有极强适应性的形态特征与生物学特性，在西方蜜蜂引入之前我国中华蜜蜂基本保留着多个地方品种[4]。从1896年起，具有优良经济性状的西方蜜蜂陆续被引入我国[5]，与中华蜜蜂发生了种间竞争并占据了种间竞争的优势，也带来了许多东方蜜蜂不曾有过的病害。同时由于西方蜜蜂具有更加优异的生产性状，蜂农更加喜爱饲养西方蜜蜂，人为进行饲养蜂种的更替，加剧了中华蜜蜂地方品种的丢失。近几十年来我国本土中华蜜蜂分布范围循序缩小，数量急剧下降，而西方蜜蜂以及其他授粉昆虫对我国森林生态系统的弥补作用有限[6]，因此保护中华蜜蜂的种质资源是当前必不可少的工作。近年来，随着中蜂的劳动强度小、投入成本低、经济效益高等优势逐渐体现，部分地区出现了中蜂养殖热情高涨的情况，一些地区的中蜂数量有所恢复。

中华蜜蜂的相关种质资源鉴定工作也已经开展。经过学者们的一系列形态调查研究，初步划分出以下9个中华蜜蜂的类型：长白山中蜂、阿坝中蜂、海南中蜂、西藏中蜂、北方中蜂、华南中蜂、华中中蜂、滇南中蜂、云贵高原中蜂。其中长白山中蜂以及阿坝中蜂由于其明显的形态特征以及对当地环境的适应性，引起了政府部门的关注，先后建立长白山中蜂资源保护区以及阿坝州中蜂资源保护区。其他品种如西藏中蜂、海南中蜂等虽也具有明显的形态以及生物学特征，但并未引起足够的关注，受到环境变化、病害以及引种等影响，蜂群数量持续下降，亟需得到保护。广泛分布于中国大陆的华南中蜂、华中中蜂、北方中蜂等，由于人为开垦农田以及病害的影响，分布区域一度收缩并且呈现碎片化趋势，但近年来部分地区的中蜂种群数量有所提升。作为适应我国森林生态系统的本土蜂种，中华蜜蜂的现状必须引起人们足够的重视，保护我国现有的中蜂种质资源。

2 蜜蜂种质资源评价方法

中华蜜蜂种质资源是畜禽资源的重要组成部分，也是我国生物多样性的重要组成部分。种质资源的管理主要包括种质资源评价、品种保存和开发利用，而针对种质资源的评价是资源管理最基本的环节[7]。

目前，对蜜蜂种质资源的评价主要是通过遗传标记从形态学特征以及生物学特性进行。近年来随着分子生物学的发展，利用分子手段对蜜蜂种质资源进行评价的工作也逐渐开展。

2.1 分子遗传标记评价方法

分子遗传标记技术由于可以直接反映生物个体或种群间的特征，已得到了广泛应用，是一种有效的遗传标记。分子标记是可检测并且稳定遗传的生物大分子，可直接反映基因水平上的遗传结构、遗传多样性等差异。至今，微卫星DNA标记和线粒体DNA片段标记，是蜜蜂种质资源评价与鉴定中应用最广泛的分子遗传标记，单核苷酸多态性SNP标记作为第三代分子标记将会发挥越来越大的作用。

2.1.1 微卫星DNA

微卫星标记（Microsatellite），又称为简单重复序列（SSR）或短串联重复序列（STRs），通常由2～6个核苷酸重复构成，均匀分布在真核生物基因组中。这种简单重复序列在寄居蟹的基因组中第一次发现[8]，随后在其他动物、酵母的基因组中都有发现，并且在研究人类基因组的微卫星序列时，得到了微卫星（microsatellite）的名字[9]。

2003年，西方研究者从西方蜜蜂的全基因组片段构建文库和细菌人工染色体克隆文库中一共开发了552个具有多态性的微卫星位点，而其中有58%的位点可以在东方蜜蜂中成功扩增并具有多态性[10]。2008年，利用西方蜜蜂全基因组开发出了共2008个微卫星位点[11]。而东方蜜蜂微卫星标记开发相对西方蜜蜂较晚，2009年日本学者成功地在东方蜜蜂中开发出12个具有高度多态性的微卫星位点[12]。除此之外，东方蜜蜂使用的微卫星标记，多是基于西方蜜蜂已有的位点筛选出在东方蜜蜂中具有多态性的标记[13]。在蜜蜂领域内，微卫星被用于遗传多样性以及蜜蜂品种鉴定的研究[14]。

2.1.2 线粒体DNA标记

线粒体DNA是唯一的处于细胞核外的遗传信息载体，其遗传特性主要体现在：母性遗传、多态、同一个体内线粒体序列一致。线粒体具有高度多态、母系遗传、较少重组以及高拷备数等特点，是研究中一种常见的分子标记[15,16]。在蜜蜂的研究领域中，一个蜂群通常有且仅有一只蜂王负责产卵，整个蜂群的线粒体结构一致，因此在实际实验过程中一只工蜂的线粒体就足以代表整个蜂群的特征。基于线粒体DNA标记的特点以及蜂群母系社会的特性，线粒体常被用于研究蜜蜂的分化鉴定等领域[17,18]。

随着分子检测技术的不断发展，分子实验的成本大大降低，对线粒体序列片段进行直接测序以获得丰富的遗传信息变得可行，因此线粒体部分片段测序成为种质资源多样性检测所使用的主要技术之一。在蜜蜂领域的研究中，tRNAleu～COII的非编码区为主要检测的线粒体片段，在近缘种西方蜜蜂的研究中起到了很好的种质资源评价作用[17,19]。在东方蜜蜂的相关研究中发现，虽然该非编码片段的变异程度相比西方蜜蜂有所减少，但仍然具有丰富的多态性[20]，依然适用于蜜蜂种质资源多样性与遗传结构的评价。此外，COI、COII、16s RNA、Cytb等线粒体DNA片段也被应用于东方蜜蜂的种质资源评价中。

2.1.3 单核苷酸多态性SNP标记

单核苷酸多态性简称SNP标记，是指基因组上某个特定位置上发生转换、颠换、插入或缺失等变化，且该等位基因在种群中的比例不低于1%[21]。SNP标记具有数量多、分布广和遗传稳定等特点，广泛分布于基因组的编码序列或非编码区中。其中位于编码区内部的SNP位点（cSNP）较少，但对于研究生物的表型性状等具有非常重要的意义，可以作为鉴定不同种质资源的重要标记[22]。第三代高通量测序技术的推广也为SNP的研究提供了便利。研究表明西方蜜蜂存在约830万个SNP位点，其中分布于非洲的A支系拥有最高的基因突变频率，存在约650万个SNP位点，位于欧洲大陆的C支系仅有约220万个SNP位点，不同支系的西方蜜蜂支间约有43%的SNP位于蛋白编码区中[23]。在筛选西方蜜蜂抗白垩相关研究中也发现SNP C2587245T位点与西方蜜蜂抗白垩病性状高度相关[24]。随着测序成本的逐渐降低，SNP标记将会在蜜蜂领域发挥越来越大的作用。

2.2 分子水平种质资源评价相关指标

对种质资源的评价，常用的指标有核苷酸多样度、平均核苷酸差异数、单倍型多样度、有效等位基因数、多态信息含量、观察杂合度、期望杂合度、香农指数、基因丰富度等。

2.2.1 核苷酸多样度（Pi）

核苷酸多样度是指在一份样本中，随机挑选两个序列比对，每一个位置可能出现不同的核苷酸频率，或是指不同的核苷酸位点在总位点中所占的比率[25]。

2.2.2 平均核苷酸差异数（K）

平均核苷酸差异数是将全部个体核苷酸变异数的总和除以个体总数[25]。

2.2.3 单倍型多样度（Hd）

单倍型多样度是指在一份样本中随机抽到两个不同单倍型的频率，越高的单倍型多样度意味着种质资源的多样性越丰富[25]。

2.2.4 杂合度

杂合度主要包括观察杂合度和期望杂合度两个指标，杂合度的高低与种群的适合度相关，若杂合度指标下降，意味着该种群灭绝的可能性增加[26]。

观察杂合度（Ho），是指每个位点实际观察到的杂合子的比例。期望杂合度（He），是指在Hardy-Weinberg平衡条件下，理论上杂合子所占的比例[27]。

2.2.5 多态信息含量（PIC）

多态信息含量，简称PIC值，指用作连锁分析的父本与母本的配对而产生的子代中遗传标记多态性的信息量。目前仅在关于人类的研究中认定PIC值≥0.6为具有丰富的多态信息含量[28]，对于其他物种的判断尚未有明确的标准。在蜜蜂种质资源的评价鉴定中，如何判断PIC值的水平需要进一步研究。

2.2.6 香农指数（I）

香农指数多应用于物种或种下的多样性评价。在研究种质资源多样性时，香农指数不仅可以体现等位基因数量的多少，还体现了不同等位基因所占的比例[29]。

2.2.7 基因丰富度（Rs）

基因丰富度也叫平均等位基因数（Na），表示每个位点上所有的等位基因的数量。由于受到有效种群大小的影响，该指标能够反映种群数量在历史上的波动。

2.2.8 有效等位基因数（Ne）

有效等位基因数是指在理想状态下，形成与实际种群中相同的纯合度（或杂合度）所需要的等位基因数。研究中常用平均有效等位基因数来评价种群遗传多样性水平。

2.2.9 Hardy-Weinberg平衡检测

Hardy-Weinberg平衡认为在理想种群中，各等位基因的基因频率和基因型频率将保持在一个稳定不变的水平。Hardy-Weinberg平衡受自然选择、人工选择、近交等诸多因素的影响，检验种群是否符合Hardy-Weinberg平衡，是评价种质资源的基础[30]。

2.2.10 F统计量

F统计量包括3个参数，分别为种群间近交系数Fit、种群内近交系数Fis、种群间的分化程度Fst[31]。Fis、Fit分别相当于地方种群和所有种群中任何个体携带的一对等位基因是同源的概率；Fst是指任意两个种群间的变异占所有变异的比例，是衡量两个种群分化的一个参数。

3 结语

蜜蜂种质资源保护是一项长期的任务，除了需要人类在保护自然环境方面做出更多努力外，相关领域的研究人员更需要先对现有的蜜蜂种质资源进行评价，运用现有技术对中蜂进行品种鉴定，并建立起中蜂保种场。针对已有的保种场也要积极进行保种效果评估，为接下来的中蜂资源保护工作提供理论与实践上的指导。