辣椒全基因组测序材料Capsicum annuum cv.CM334再生体系的建立

张根莲,张 凯,郭广君,潘宝贵,刁卫平,刘金兵,戈 伟,王述彬*

(1.南京农业大学 园艺学院,江苏 南京 210095;2.江苏省农业科学院 蔬菜研究所/江苏省高效园艺作物遗传改良重点实验室,江苏 南京 210014)

辣椒(Capsicumspp.)属于再生顽拗型植物,由于基因型特异性与离体培养效率密切相关,迄今为止仍没有建立通用的辣椒组织培养再生体系[1]。曹亚从等的研究结果显示,2个辣椒基因型的平均再生率分别为8.19%和10.00%,显著高于3个甜椒基因型[2]。龙凤等发现9个辣椒基因型材料的子叶、下胚轴的芽分化频率差异较大,变化范围在50%～90%[3]。外植体类型对组织培养再生也有很大的影响。唐亮等研究认为辣椒茎尖的再生能力优于子叶[4]；Ezura等利用带有部分胚根和下胚轴的半粒种子获得了再生植株[5]；但是多数研究认为辣椒子叶的再生能力最强,芽诱导率最高可达100%,芽伸长率最高可达50%[6-10]。在芽分化阶段,通常在培养基中添加植物生长调节物质促进芽的分化,使用较多的是3-吲哚乙酸(3-indole-acetic, IAA)、6-苄氨基嘌呤(6-benrylaminopurine, 6-BA)[11-12]、玉米素(Zeatin, ZT)、噻苯隆(Thidazuon, TDZ)等[13-14]；另外，添加AgNO3等也可以提高芽诱导率[15]。在芽伸长阶段,通常降低6-BA的浓度,并加入赤霉素(gibberellic acid, GA3)来促进芽的伸长[16-19]。

在2014年,辣椒CM334(Criollo de Morelos 334)全基因组测序完成[20],为辣椒基因功能的研究打开了新的一页。本项目组在前期研究中,以高抗黄瓜花叶病毒(CMV) 辣椒材料PBC688和高感CMV辣椒材料G29建立遗传群体,鉴定得到1个抗CMV的主效QTL,命名为qCmr2.1[21]。为了进一步分析抗CMV候选基因的功能,需要建立这3个辣椒基因型的组织培养再生体系,以用于辣椒抗CMV候选基因的分子机制研究。因此，我们以CM334、PBC688以及G29为试验材料,以子叶和下胚轴为外植体进行了辣椒组织培养再生研究。

1 材料与方法

1.1 植物材料

以3个辣椒基因型为试验材料。CM334(Capsicumannuum)引自韩国,其果实为小羊角形,横径1.0 cm，纵径5～6 cm,为辣椒全基因组测序材料;PBC688(C.frutescens)引自亚洲蔬菜研究发展中心,其果实为纺锤形,横径0.5 cm,纵径1.0 cm,高抗CMV;G29(C.annuum)由江苏省农业科学院蔬菜研究所提供,其果实为灯笼形,横径5～6 cm,纵径6～7 cm,高感CMV。

1.2 无菌苗的培养

挑取饱满的辣椒种子,先用70%酒精浸泡30 s,再用2%次氯酸钠溶液消毒20 min,然后使用无菌水清洗 5次,播于播种培养基(表1)[16,22-23]上,置于26 ℃、黑暗条件下发芽1周左右,最后移于温度26 ℃、光照周期16 h/8 h(昼/夜)条件下培养。

1.3 不定芽的诱导和分化

在培养10～12 d后,剪取幼苗的子叶、下胚轴(子叶切块长度和宽度均为0.5 cm,下胚轴切段长度为1.0 cm),接种在芽分化培养基(表1)[24]上；芽分化培养基中的DJ为辣椒幼苗的提取汁液,并过滤灭菌[25]。每2周继代1次,培养条件为温度26 ℃、光照周期16 h/8 h(昼/夜)。在诱导分化培养40 d时统计不定芽的发生情况,计算芽分化率，其公式为：芽分化率=(分化出再生芽的外植体个数/外植体个数)×100%。

表1 辣椒外植体组织培养的再生培养基

1.4 不定芽的伸长

将经过2～3次芽分化诱导培养后形成的带茎不定芽切下,转移到芽伸长培养基(表1)[1],每2周继代1次,培养条件与不定芽的诱导和分化培养条件相同。在伸长培养20 d时统计不定芽的生长情况,计算芽伸长率，其公式为：芽伸长率=(外植体上伸长的再生芽总个数/外植体上分化出的再生芽总个数)×100%。

1.5 生根与移栽

在不定芽伸长至1.5～2.0 cm时,自基部切下,移植至生根培养基(表1)[25-26],培养条件同不定芽诱导和分化培养。在植株生根30 d后统计生根率：生根率=(生根的植株个数/外植体个数)×100%。待植株长成健壮的小苗后,打开瓶盖炼苗48 h,移植于营养钵中,用塑料薄膜覆盖保湿3 h,置于温度26 ℃/20 ℃、光照周期16 h/8 h(昼/夜)、相对湿度60%条件下培养,正常管理。

2 结果与分析

2.1 不同激素配比对辣椒再生芽诱导分化的影响

激素配比会影响辣椒组织培养再生芽的分化效率(表2)。在芽分化培养基中添加5.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA, CM334子叶和下胚轴的再生芽数分别为13个和5个, G29子叶和下胚轴的再生芽数分别为3个和2个, PBC688则无外植体分化出再生芽。在添加1.0 mg/L IAA+5.0 mg/L 6-BA的基础上再添加2.0 mg /L ZT,可加快诱导外植体的分化,但形成的叶状体呈簇状生长,其上诱导出的带生长点的再生芽减少,且后期很难伸长，因此,CM334和G29分化出再生芽的外植体个数减少,但PBC688的1个下胚轴外植体分化出再生芽，说明添加不同浓度的ZT对于芽的分化无明显的促进作用。综上所述，1.0 mg/L IAA和5.0 mg/L 6-BA有利于辣椒外植体再生芽的分化,以MS+5.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA作为芽分化培养基, CM334的芽分化率达到10.74%。

表2 不同激素及其配比对辣椒子叶与下胚轴再生芽分化的影响

2.2 不同激素配比对辣椒再生芽伸长的影响

激素配比对再生芽伸长同样具有重要作用(表3)。在培养基添加0.25 mg/L ZT和0.50 mg/L ZT后芽伸长率分别为3.53%和2.50%,添加0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA后芽伸长率为2.63%,均可促进再生芽的伸长。但当ZT或者6-BA浓度高于1.0 mg/L时则抑制再生芽的伸长,导致无再生芽伸长。有研究认为,在芽伸长培养基中添加低浓度的细胞分裂素(ZT或6-BA和IAA组合)和2.0 mg/L GA3可促进再生芽的伸长,但是芽伸长率具有明显差异[25]。本研究在培养基中同时添加0.25 mg/L 6-BA、1.0 mg/L IAA和2.0 mg/L GA3后,辣椒芽伸长率为8.62%;若以0.25 mg/L的ZT替代0.25 mg/L 6-BA和1.0 mg/L IAA组合,则辣椒芽伸长率仅为2.94%;如果ZT、6-BA的浓度均增加至0.5 mg/L,则芽伸长率分别为3.03%和10.66%。因此,本研究中促进辣椒再生芽伸长的最优激素配比为0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA+2.0 mg/L GA3,而ZT替代6-BA和IAA组合的效果不佳。

2.3 基因型与外植体对辣椒组织培养再生的影响

利用优化后的激素配比对3个辣椒基因型进行组织再生培养,研究结果表明： CM334的再生能力最强,以子叶和下胚轴为外植体时,芽分化率分别为10.74%和4.85%,每个外植体平均再生芽数分别为4.23个和3.00个,芽伸长率分别为54.54%和53.33%,生根率分别为24.79%和7.76%,最终获得再生植株38株；高抗CMV基因型PBC688的再生能力居中,获得13个伸长的再生芽,其中1株生根；高感CMV基因型G29为甜椒类型,再生能力最差,最终诱导出5个可伸长的再生芽,获得生根植株1株(表4)。

表3 不同激素及其配比对辣椒再生芽伸长率的影响

本研究使用3个辣椒基因型的子叶和下胚轴作为组织培养再生的外植体,子叶外植体的平均分化率为3.70%～10.74%,高于下胚轴外植体的平均分化率。CM334的子叶外植体的分化率为10.74%，生根率为24.79%,均高于下胚轴外植体的,但是两个外植体的芽伸长率无明显差异。PBC688和G29的子叶外植体的分化率、芽伸长率均高于下胚轴外植体的(表4)。

2.4 CM334组织培养植株再生

将CM334的子叶和下胚轴作为外植体,接种于分化培养基MS+5.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA+5000.0 mg/L DJ+10.0 mg/L AgNO3,在培养7 d左右后外植体伤口处出现淡黄色或白色愈伤组织(图1A、图2A)；在培养20 d左右后可见绿色芽点(图1B、图2B)；在培养30 d左右后可分化形成带有生长点的再生芽或者无生长点的叶状体(图1C、图2C)。在培养40 d左右后将带有生长点的再生芽切下，接种至伸长培养基MS+0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA+5000.0 mg/L DJ+10.0 mg/L AgNO3,进行再生芽的伸长培养(图1D、图2D)。在60 d左右当再生芽伸长至3～5 cm时,将其接种至生根培养基MS+0.2 mg/L IAA+0.1 mg/L NAA,在90 d左右时生成健壮的根系(图1E、图2E)。在小苗根系生长发达后,炼苗15 d后移植至营养钵中,进行正常栽培管理(图1F、图2F)。

表4 不同辣椒基因型外植体的组织培养再生结果比较

A:开始出现愈伤组织;B:形成不定芽或叶状体;C:不定芽剪切转移至芽诱导分化培养基中伸长;D:再生芽在伸长培养基中生长;E:再生植株伸长且形成健壮根系;F:移栽的再生植株。图1 CM334下胚轴再生体系的建立

A:开始形成愈伤组织;B:出现绿色芽点;C:分化出不定芽或叶状体;D:再生芽在伸长培养基中伸长;E:再生小苗生成健壮根系;F:移栽的再生植株。图2 CM334子叶再生体系的建立

3 讨论

辣椒再生芽的诱导和分化对辣椒组织培养再生体系建立起到关键作用。多数研究认为IAA、6-BA、BA、TDZ、ZT等不同配比对芽分化有诱导作用。余小林等、孙月芳等的研究表明,在芽诱导培养基中添加5.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA,辣椒子叶芽分化频率最高,芽长势最好[27-28]。本研究采用5.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA,再生芽的诱导分化数量大幅提升,这与何晓明和曹冬孙等的研究结果[29-30]相同。Li研究认为ZT可替代IAA+6-BA的组合促进再生芽的诱导分化[31]。本研究发现,在芽诱导分化阶段,不同浓度的ZT可促进形成大量的愈伤组织,但是后期愈伤组织上形成的再生芽很少,只在CM334子叶外植体上诱导形成4个再生芽(表2)。在芽诱导培养基中同时添加2.0 mg/L ZT与5.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA后,可加快诱导外植体的分化,但形成的叶状体呈簇状生长,其上诱导出的带生长点的再生芽减少,且后期很难伸长。这一现象在其他研究中未见报道。因此本研究中诱导培养基中最佳的激素配比为5.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA。

除不定芽的诱导分化外,辣椒离体培养的另一难点在于再生芽的伸长。曾华等发现在添加0.5 mg/L 6-BA和1.0 mg/L IAA或者0.2 mg/L IAA和1.0 mg/L ZT的培养基上,同时添加2.0 mg/L GA3和5.0 mg/L AgNO3对不定芽的伸长效果最好[32]。Bairwa等研究发现,芽伸长阶段在MS培养基中添加5.0 mg/L PG (间苯三酚)+0.3 mg/L GA3,不定芽伸长效果最好[33]。本研究结果表明：添加0.25 mg/L ZT、0.5 mg/L ZT或者0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA可以促进再生芽的伸长,但是芽伸长率很低;添加1.0 mg/L ZT或者1.0 mg/L 6-BA即可抑制再生芽的伸长,导致无再生芽伸长。这与繆武等的研究结果[34]一致。本研究还发现,在0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA的基础上添加2.0 mg/L GA3后,芽伸长率显著提高。罗素兰等研究认为0.5 mg/L 6-BA+2.0 mg/L GA3最利于不定芽的伸长[35]。因此本研究优化的芽伸长培养基激素配比为0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA+2.0 mg/L GA3。

辣椒再生具有严重的基因型依赖性,导致目前为止还未能建立普适的辣椒再生体系。多数研究认为辣椒基因型(有辣味)不定芽的诱导分化能力高于甜椒基因型(无辣味)的[1-2,14]。本研究选用3个辣椒基因型,其中辣椒CM334的生根率达到24.79%,甜椒G29的再生能力(生根率)仅为0.61%(表4)。这一结果与前人的研究结果[36-37]相符。另外也有研究认为,甜椒基因型与辣椒基因型之间的芽分化频率和芽伸长率没有特定的规律性[25]。

辣椒离体再生中外植体的类型有多种,如子叶、下胚轴、真叶、茎尖、茎节、根、花药、原生质体、胚等,其中子叶和下胚轴应用最为广泛[9,30,37]。虽然不同外植体均可诱导成功,但是不同类型的外植体的再生能力差异明显。本研究中3个基因型子叶的再生能力均高于下胚轴的,且下胚轴诱导出的再生芽仅有少量伸长。这一结果与Elwan、王玉文、叶志彪等的研究结果[8,37-38]一致。与之相反的是,有研究认为以带胚根和部分下胚轴的半粒种子作为外植体,不定芽的诱导率最高，超过95%[39],优于以子叶和下胚轴为外植体的[2]。

本研究针对3个特定的辣椒基因型进行了离体再生培养,并对全基因组测序材料CM334建立了成熟的离体再生体系,获得了38株再生植株；虽然高抗CMV和高感CMV基因型的离体再生效率较低,但是也均获得了1株再生植株,可以满足后续候选基因分子机制研究的需求。尤为重要的是,CM334作为辣椒研究的“模式植物”,其组织培养再生体系的建立为辣椒分子生物学研究提供了有力的技术支撑。