脓毒症时中性粒细胞的生物学行为

孙炳伟

0 引 言

脓毒症与感染侵袭相关，临床表现为系统性炎症的综合征[1]。脓毒症时的炎症动态变化包括最初的全身炎症反应综合征，随后的暂时性代偿抗炎反应综合征，及一种连续、高度混合的抗炎反应综合征[2]。考虑到脓毒症对器官的严重损害及对生命的威胁，了解脓毒症的具体病理生理学具有重要意义。脓毒症的病死率较高，这可能和脓毒症的机制复杂相关。晚期的治疗针对某些分子相关，如TNF-α的单克隆抗体、IL-1β的受体拮抗剂和内毒素抗体等效果均未达预期[3-4]。因而，理解脓毒症的错综复杂和异质性可以更好地解决脓毒症相关问题。除了脓毒症后强烈炎症反应引发的休克和多器官功能障碍，脓毒症病理过程中的中性粒细胞异常的生物学行为也是导致脓毒症发病、死亡的原因之一[5]。本文探讨脓毒症时中性粒细胞功能障碍及其生物学行为的异常表现，并讨论了相关的临床意义。

1 脓毒症时中性粒细胞功能失调

中性粒细胞起源于骨髓，随之离开血液，招募并迁移到血液中炎症部位，并最终被清除[5]。既往研究对于中性粒细胞的生命过程已有详细的描述；然而在脓毒症期间，这些生命过程发生了不可控的改变。在脓毒症早期，骨髓内的成熟中性粒细胞可迅速迁出，与正常情况相比，数量可在若干小时内增加10倍。中性粒细胞从骨髓释放、迁移到感染部位，主要归因于趋化因子，包括白三烯B4、C5a、趋化因子IL-8和细菌产物[6]。最近一些新发现的重要趋化因子也参与了这个过程，主要与中性粒细胞在骨髓中的滞留相关[7]。此外，粒细胞集落刺激因子通过改变骨髓中基质细胞衍生因子-1和CXCR2配体间的平衡间接动员中性粒细胞，触发中性粒细胞释放到循环中[5]。

感染是机体病理状况的反映。中性粒细胞作为针对细菌和真菌病原体的第一道防线，被招募到感染部位。经典的白细胞募集级联过程包括若干步骤，即滞留、滚动、黏附、爬行以及穿膜[8]。这是一个多步骤黏附级联过程，各种细胞膜分子及其相互作用参与其中。然而在脓毒症期间，这种反应失调，伴随着中性粒细胞的异常积累，中性粒细胞向感染灶募集受损，中性粒细胞迁移受损[1]。值得注意的是，脓毒症时中性粒细胞膜改变，变得更加僵硬且不易变形，这种细胞膜的变化与脓毒症的严重程度密切相关。这一改变导致中性粒细胞在毛细血管床中积聚，特别是积聚在肺和肝血窦的毛细血管，进而导致微血管闭塞，组织缺血继而发生多器官衰竭[9]。NO及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)与中性粒细胞迁移受损呈正相关，其下调中性粒细胞迁移主要与以下3个方面相关：①iNOS抑制白细胞选择素及β-整合素的表达，下调VCAM-1； ②NO和其他分子相互作用形成过硝酸盐，进而降低中性粒细胞的趋化能力及其与内皮的相互作用；③NO诱导HO-1表达，影响中性粒细胞滚动和黏附[8,10]。

此外，脓毒症患者的血清和呼出气体中，CO和胆红素水平的提高表明HO-1通路在此过程中也扮演着重要的角色[11]。细胞表面和核内表达的蛋白，如CXCR2型、C-C趋化因子受体(C-C chemokine receptor, CCR)2型和过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferators-activated receptors, PPARs)γ介导了中性粒细胞迁移的损害[3,12]。其参与可以通过以下方式证明：①脓毒症患者中性粒细胞CXCR2表达下调，脓毒症小鼠中性粒细胞CCR2表达上调，可能与Toll样受体(toll-like receptors，TLR)相关；②脓毒症患者或是小鼠中性粒细胞PPARγ表达上调。此外，脓毒症时中性粒细胞迁移的方向受损，相关机制尚未明确。

2 中性粒细胞的凋亡

为维持中性粒细胞的稳态，精细管理中性粒细胞的输入和输出平衡也是关键。中性粒细胞的清除主要通过巨噬细胞、树突细胞和淋巴结[12]。中性粒细胞的凋亡是一种维持其稳态的重要因素，对于凋亡的中性粒细胞可通过巨噬细胞来清除[13]。然而在脓毒症患者中，中性粒细胞的凋亡延迟可能导致相关的组织损伤与多器官功能障碍综合征[14]。目前，调节这个过程的机制尚不完全清楚。最近研究发现，一些炎症介质，如粒细胞 - 巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)、IL-18均通过调节促凋亡基因和抗凋亡基因，从而调控细胞的凋亡[15-16]。值得注意的是，这些凋亡因子的上游调节因子也参与了脓毒症时中性粒细胞凋亡的延迟。此外，线粒体跨膜电位的改变和caspase 3、9 活性降低也参与了细胞凋亡的抑制[17]。中性粒细胞的凋亡还伴随形成一种中性粒细胞外的诱捕网(neutrophil extracellular traps，NETs)，主要包含核组件和一些修饰蛋白[9]。在脓毒症时，NETs就像一把双刃剑：可以通过NET相关分子捕获病原菌，还能导致组织损伤。

3 中性粒细胞的自噬

自噬是一种高度保守降解受损细胞器和大分子物质的过程，是真核生物特有的生物学行为[18]。自噬在中性粒细胞基础状态下即存在，在细胞营养匮乏、内质网压力、氧化应激、低氧和特定化学物质的暴露下被大量激活。中性粒细胞的自噬体膜脱落形成分隔膜包绕在目降解物周围，分隔膜延伸包绕形成自噬体，自噬体与溶酶体融合降解其内成分，自噬体脱落进入再循环[19]。自噬不仅是中性粒细胞天然免疫的一种反映，也通过递呈抗原给淋巴细胞调节获得性免疫[20]。自噬对中性粒细胞的生物学功能上发挥着重要的调节作用，影响着中性粒细胞的寿命、脱颗粒和NETs的形成[21-22]。自噬双向调控中性粒细胞的寿命。一方面自噬可以维持中性粒细胞氧化应激状态下的生存，清除细胞内的坏死物质。在增殖早期，自噬提供分化所需的必需脂肪酸帮助中性粒细胞克服营养消耗的改变，一旦自噬受损，中性粒细胞的前体细胞过度的糖酵解使得脂肪小滴聚集能量损耗[23-24]。另一方面细胞凋亡蛋白可在自噬体中被激活，自噬体降解部分内生的凋亡抑制产物，从而加速细胞凋亡[25-26]。自噬影响中性粒细胞的脱颗粒，特别是第2级细胞颗粒，已证实敲除Atg5或Atg7这2个自噬的关键分子导致中性粒细胞颗粒释放缺陷[27-28]。自噬促进细胞代谢和NET的动力形成，自噬的相关分子参与到NET的形成，其中mTOR是联系自噬和NET的形成的关键分子，抑制mTOR可以促进自噬从而加速NET的形成[29-31]。脓毒症状态下中性粒细胞自噬的发生过程及分子机制见图1。

图 1 脓毒症状态下中性粒细胞自噬的发生过程及分子机制

中性粒细胞的自噬与感染性疾病、炎症和肿瘤的发病机制息息相关，通过药物调节中性粒细胞的自噬也可作为崭新的治疗手段[32]。自噬可监测和消除细胞内逃逸的病原体，并促进NET和细胞的凋亡，在感染性疾病中上调自噬可大大增加病菌的清除效率[20]。自噬是炎症状态下中性粒细胞的一种自我保护机制。它能减少细胞因子的释放，从而控制炎症，自噬的紊乱会导致炎症的失控[33-34]。

4 中性粒细胞的焦亡

细胞焦亡是一种Caspase-1或Caspase-4/5/11依赖的伴随炎症的细胞程序性死亡方式[35]。发生焦亡的细胞会形成大小与凋亡小体类似的焦亡小体，伴有细胞核固缩、染色质损伤，细胞膜上形成大量孔隙，使其失去完整性，最终胞膜溶解,胞内内容物释放诱发炎症[36]。近年来的研究表明，在病原体感染时，焦亡也是中性粒细胞发挥其生物学功能的一种重要方式[37-38]。中性粒细胞发生焦亡的过程中会持续加工并分泌成熟IL-1β和IL-18，最终细胞胀大,胞膜溶解，产生胞质DAMP，释放大量免疫调节因子如IL-10、IL-13等，趋化因子如IL-8、MIP-1α等，以及髓过氧化物酶、组织蛋白酶G等多种颗粒酶[39-40]。中性粒细胞胞膜溶解后，胞内的病原微生物并未被直接释放到胞外，而是形成一种孔诱导的胞内陷阱(pore-induced intracellular traps，PITs)。PIT通过补体和清道夫受体来协调先天免疫反应，促进招募中性粒细胞释放ROS或者二次吞噬杀死病原体[41-42]。中性粒细胞焦亡过程中生产的成熟IL-1β和IL-18是炎症反应时IL-1β和IL-18的主要来源[43-44]。通过这2种重要的促炎因子，中性粒细胞可产生广泛的调节作用，如激活内皮黏附分子、诱导发热反应、诱导特异性免疫反应[45]；并促进Th1型细胞、NK细胞和细胞毒性T细胞生成γ干扰素；促进CD8+T细胞和NK细胞增殖；刺激其他免疫细胞分泌细胞因子[46]。发生焦亡的中性粒细胞胞膜溶解后，细胞器和细胞骨架并未简单散开，而是在细胞尸体内仍保持联系，形成一种陷阱样的结构,并将仍然存活的病原体困在其中，这种结构被称为PITs[41-42]。随后被困在PITs中的病原体被中性粒细胞释放的ROS杀死或被吞噬细胞二次吞噬消灭[36]。PITs在概念上类似于NETs,都是通过包埋细菌防止其传播并促进清除，两者的最主要区别在于NETs针对的是胞外病原体，而PITs针对的是胞内病原体[47-49]。脓毒症状态下中性粒细胞焦亡的发生过程及分子机制见图2。

图 2 脓毒症状态下中性粒细胞焦亡的发生过程及分子机制

已经有多项研究表明，中性粒细胞焦亡有利于细菌感染时机体对细菌的清除[36,49]。与此同时，也有报道显示，同时拮抗IL-1β和IL-18或者Caspase-1-/-和Caspase-11-/-敲除的小鼠在CLP模型和脓毒症休克模型中都显著提高生存率[50-52]。这些矛盾的结论提示我们，对中性粒细胞的生物学行为还需要进行更深入、系统的研究，才能对脓毒症这样一种复杂的双相综合症进行更合理的治疗[53]。