丹参治疗糖尿病肾病的网络药理学研究

吴芳， 李克明， 隆毅， 王桂芝

（1.东营市第二人民医院，山东东营，257335；2.山东省中医药研究院，山东济南，250014；3.山东中医药大学第二附属医院，山东济南，250001；4.德州市中医院，山东德州，253013）

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是常见的微血管并发症，其具有发病率高、致残率高、危害性大、难以治愈等特点。流行病学研究显示，我国糖尿病患者已高达9 240万人[1]，且趋向年轻化，DN也出现相同的趋势[2]，由DN造成的终末期肾病比例为15%[3]。近年来，丹参制剂在治疗DN方面取得了一定的进展[4-6]，本院自制剂丹参降糖方在治疗DN中也取得了良好的临床疗效。其中丹参发挥着重要作用。基于此，为进一步探讨丹参单味药所起到的可能作用机制，为后续深入复方药理研究提供坚实的理论基础，本研究拟采用网络药理学对其进行分析。网络药理学（Network Pharmacology）利用复杂网络与可视化技术，结合中药治疗疾病具有多靶点、多途径与多靶点协同作用的特点，可为中医药机制研究提供新思路与途径[7]。现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1丹参入血活性成分筛选应用中药系统药理学数据库和分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）[8]检索出丹参成分的数据，通过成分药物动力学[9]参数进行筛选[10-12]。筛选的条件[13]为药物口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，药物相似性（drug-likeness，DL）≥0.18；参考前期研究结果与文献信息适当增补删减。

1.2丹参调控靶点预测与“活性成分—靶点”网络构建利用TCMSP作用靶点预测模型演算上述入血活性成分的作用靶点，通过网络图像化软件Cytoscape 3.2.1构建“活性成分—靶点”网络，分析其网络特征[14]，其中“节点”（node）表示分子与靶蛋白，“边”（edge）表示丹参成分与靶点之间的关系。

1.3已知的DN相关疾病靶点检索检索TTD[15]（http：//bidd.nus.edu.sg/BIDD-Databases/TTD/TTD.asp） 、 DrugBank[16]（https：//www.drugbank.ca/） 、OMIM[17]（http：//www.omim.org/）、GAD[18]（https：//geneticassociationdb.nih.gov/）、PharmGKB[19]（https：//www.pharmgkb.org/）等与疾病靶点相关的数据库，以“diabetic nephropathy”为关键词对DN疾病相关靶点进行检索。

1.4蛋白质—蛋白质相互关系网络构建和关键靶点筛选药物调控机体的病理生理过程往往存在极为复杂的网络关系，除直接作用靶点外，更广泛地存在间接调控的方式；通过蛋白质—蛋白质相互作用关系（protein-protein interaction，PPI）数据的构建与挖掘为研究其复杂关系提供了途径。利用插件“BisoGenet”对上述入血活性成分和疾病靶点分别进行PPI网络构建和映射。

通过前期研究与网络拓扑分析插件“CytoNCA”[20]得到上述网络关系中的自由度中心性（degree centrality，DC）、介度中心性（betweenness centrality，BC）、接近中心性（closeness centrality，CC）、特征向量中心性（eigenvector centrality，EC）、网络中心性（network centrality，NC）和局部边连通性（local average connectivity，LAC）等指标。筛选标准：①DC值大于所有节点DC值中位数2倍的重要节点；②其他几个指标大于所有节点中位数的节点，即得到关键基因。

1.5Pathway富集分析ClueGO是整合了基因本体论信息资源数据库（GO）与京都基因和基因组百科全书（KEGG）相关数据。本研究采用“ClueGO”[21]对以上获得的关键靶点进行信号通路富集分析以研究丹参治疗DN可能的靶点与关键通路。其中，不同颜色的节点代表不同类型的信号通路，而其大小与信号通路呈正相关。

2 结果

2.1丹参活性成分筛选与吸收、分布、代谢和排泄（ADME）性质分析本研究通过TCMSP数据库共检索到丹参所有成分202个，根据OB和DL等ADME参数筛选到入血活性成分65个，见图1。

图1 根据ADME参数筛选出的丹参入血活性成分分布Figure 1 Distribution of the blood active ingredients in Radix Salviae Miltiorrhizae screened with ADME parameters

2.2丹参作用靶点预测及“活性成分—靶点”网络构建分析利用TCMSP靶点预测模型预测技术对上述活性成分进行作用靶点预测，排除重复靶点，共获得预测靶点103个，相互对应关系1 349条；其中4个活性成分无对应靶点，予以排除。利用Cytoscape构建上述入血活性成分及预测的作用靶点的关系网络，如图2所示。

2.3DN相关靶点检索分析通过检索疾病基因相关数据库，并搜集前期研究和报道共获得与DN发生、发展密切相关的已知的相关靶点基因113个，其中TTD、DrugBank、OMIM、GAD、Pharm GKB数据库分别检索到23、2、43、62、3个。

2.4丹参治疗DN的PPI网络构建与关键靶点筛选分析

2.4.1 丹参治疗DN的PPI网络构建分析 通过插件“BisoGenet”对丹参入血活性成分的作用靶点进行PPI网络构建可知，与其产生直接或间接作用的靶点共5 896个，而这些靶点与靶点之间的相互关系多达131 478个；而与DN疾病相关靶点多达2 842个，靶点与靶点相互关系55 643个。

2.4.2 丹参治疗DN的关键靶点筛选分析 通过Cytoscape对上述绘制的2个PPI网络图抽取交集网络，采用CytoNCA根据网络节点的拓扑属性筛选共发现关键节点112个。见筛选策略示意图3。

图2 丹参“活性成分—靶点”网络图Figure 2 Compound-target network of Radix Salviae Miltiorrhizae

图3 丹参治疗DN关键节点的目标筛选策略图Figure 3 Target screening strategy for key nodes of Radix Salviae Miltiorrhizae for the treatment of DN

2.4.3 丹参治疗DN的机制分析 本研究利用ClueGO对上述关键节点进行富集分析，结果显示，丹参作用于DN的关键节点涉及的信号通路，去除过于宽泛的信号通路，获得26条被显著富集的信号通路；按照其显著程度排序依次为雌激素信号通路、神经营养因子信号通路、甲状腺激素信号通路、磷脂酰肌醇-3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶（PI3K-Akt）信号通路、ErbB信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路、催乳素信号通路、缺氧诱导因子1（HIF-1）信号通路、B细胞受体信号通路、核因子kappaB（NF-κB）信号通路、T细胞受体信号通路、Ras信号通路、叉头状转录因子O亚家族蛋白（Fox O）信号通路、趋化因子信号通路、白细胞介素17（IL-17）信号通路、Toll样受体信号通路、胰岛素（Insulin）信号通路、Wnt信号通路、Hippo信号通路、GnRH信号通路、Adipocytokine信号通路、cAMP信号通路、Notch信号通路、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路及转化生长因子β（TGF-β）信号通路。通路富集分析见图4、图5。

3 讨论

目前DN是糖尿病的严重并发症之一，是世界范围内终末期肾病的主要原因，临床上以蛋白尿和肾脏的形态学及超微结构改变为特征[22]。DN发病机制复杂，涉及高血糖、糖基化终末产物（AGEs）、血流动力学紊乱、代谢异常、炎症因子和氧化应激。虽然目前对DN的认识不断增加，但除了控制血糖、血脂水平和高血压之外，仍缺乏专门针对DN发病机制的治疗策略。因此，大多数DN患者的预后较差，尤其是晚期DN患者。如诊治延误，发展到肾病末期，则只能采用透析甚至是肾移植[23，24]。

中医药凭借整体观念和辨证论治理论，在治疗DN中研究发挥着重要的作用[25]。DN属于中医学“消渴”、“水肿”、“尿浊”和“关格”等范畴，《圣济总录》云：“消渴病久，肾气受伤，肾主水，肾气虚衰，气化失常，开阖不利，能为水肿。”本院自制剂丹参降糖方治疗DN取得了良好的临床疗效，丹参作为君药发挥至关重要的作用，但其作用机制尚不明确，故基于网络药理学预测丹参单味中药在DN的作用机制和关键通路。

本研究筛选丹参中入血的活性成分65个，模拟预测103个可能的靶点和1 349个相互关系。“活性成分—靶点”网络分析结果显示，丹参酮类、丹参螺旋缩酮内酯、新隐丹参酮、丹参二醇、木犀草素、多孔甾醇、紫丹参戊素等有效成分能作用于网络中的多个靶点，而IL-2、细胞周期蛋白依赖性激酶2（CDK2）、雌激素受体1（ESR1）等靶点也能与多个成分作用。基于上述结果可知，丹参的入血活性成分不仅存在协同关系，而且其调控的靶点在DN病理进程中起着关键作用。

图4 丹参治疗DN信号通路富集分析网络图Figure 4 Enrichment analysis of the signaling pathway of Radix Salviae Miltiorrhizae for the treatment of DN

图5 丹参治疗DN信号通路富集分析标注图Figure 5 Enrichment analysis label of the signaling pathway of Radix Salviae Miltiorrhizae for the treatment of DN

网络拓扑分析是提取关键靶点的过程，本研究分别通过预测活性成分作用靶点和疾病药物靶点的网络关系加以映射，以探寻靶点间的直接作用和间接作用关系，结合靶点参数进行核心筛选，最大限度地接近药物治疗疾病的真实靶点。

针对关键靶点进行通路富集分析，研究结果显示，丹参调控DN主要通过影响细胞增殖、细胞因子、炎症反应、内分泌代谢等多种因素和多通路，且上述通路与目前治疗机制类似，主要表现在：①雌激素信号通路：雌二醇通过激活酪氨酸激酶2，抑制TGF-β的合成，从而抑制胶原蛋白ⅣRNA的转录，降低胶原蛋白的表达，最终降低了DN纤维化的程度[26]；②神经营养因子信号通路：神经营养因子参与因糖尿病造成的神经系统病变的修复工作，改善DN相关症状[27]；③甲状腺激素受体信号通路：DN患者常伴随甲状腺功能的减退，甚至出现低三碘甲状腺原氨酸（T3）综合征，血清游离三碘甲腺原氨酸（FT3）指标高低与DN预后好坏呈正相关，FT3可能是DN患者预后的关键预测指标[28]；④ErbB信号通路与PI3K-Akt信号通路：ErbB是PI3K-Akt重要的上游通路，而PI3K-Akt是保肾药物作用与抑制细胞凋亡的关键通路[29]；⑤MAPK信号通路：p38MAPK被多种上游病理因素激活后可诱导下游炎症细胞活化，导致DN肾组织损伤[30]；⑥HIF-1信号通路：DN早期存在缺氧环境，使肾组织缺氧诱导因子lα（HIF-1α）表达增加而调控内皮素1（ET-1）的表达来参与DN病理进程[31]；⑦NF-κB、Adipocytokine、IL-17、趋化因子和Toll样受体信号通路：多种炎性因子介导的炎性反应可造成血管内皮功能减退和肾小球内皮细胞与神经细胞等损害，这可能是导致DN的重要因素之一[32]；⑧Ras信号通路：肾素—血管紧张素系统（RAS）在肾脏的异常极有可能是DN肾血流动力学病变的重要因素[33]；⑨叉头状转录因子O（FoxO）信号通路：Fox O1作为胰岛素与生长因子信号通路重要因子在调控糖脂代谢、细胞周期以及氧化应激方面发挥重要作用[34]；⑩Insulin信号通路：糖尿病患者的胰岛素敏感性受损与肾脏细胞葡萄糖代谢的改变有关，即使在血压、血糖正常的情况下，胰岛素抵抗机制依然可以推进DN蛋白尿病程发展[35]；○11Wnt和TGF-β信号通路：TGF-β 1和Wnt/β-catenin可能存在某种相互关联的协同作用持续推进DN肾间质纤维化的进程[36]；○12环磷酸腺苷（cAMP）信号通路：通过调节肠道三磷酸腺苷（ATP）和cAMP水平来调控胰高血糖素样肽1（GLP-1）的释放，从而发挥优良的降糖作用[37]；○13 Notch信号通路：被激活后可加重肾小球基底膜变厚、系膜扩张和DN纤维化[38]；○14TNF信号通路：TNF-α能促进炎性细胞聚集与粘附，扩张微血管并增加其通透性，通过诱导炎性反应最终损害肾小球组织，刺激IL-6参与微血管病变[39]。

综上所述，丹参调控DN的作用机制主要涉及细胞增殖、分化及凋亡，调节糖脂代谢、炎症反应及氧化应激等保护肾小球滤过屏障，减轻肾损伤；通路之间彼此存在着复杂而又微妙的关联，协同与拮抗作用共存，这很可能是中医药治疗本病的特点——标本兼治、双向调节，也阐明了中医药的多通路多靶点综合干预的可行性与治疗特色。基于网络药理学和生物信息学分析能有效地揭示丹参治疗DN可能的作用机制，为后续进一步临床和实验研究设计等提供了重要的理论依据，也为DN的治疗指明了新的方向。

本研究仍存在一些不足，主要表现在：①未减少药物成分的相互干扰，仅分析了本方中君药丹参的作用；②未针对糖尿病肾病不同阶段的病理状态进行亚组分析；③尚未对预测获得的关键靶点和通路进行实验验证。后续本课题将结合上述结果和前期研究数据进行更深一步的分子机制研究及临床验证。