基于噬菌体展示技术的内毒素检测方法

王鑫，徐美玲，张起莹，嵇冶，张昊

（长春理工大学 生命科学技术学院，长春 130022）

内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种成分，当细菌死亡后会大量释放。人体内毒素含量过高会导致发热、心跳过速、低血压、休克甚至死亡[1]。因此人体内毒素检测一直是临床及医疗器械、药物检测的必检指标。目前常规的检测方法主要有：凝胶法、浊度法和比色法。但原理都是基于内毒素能与鲎试剂发生特异性反应。鲎是国家二级保护动物，随着检测市场需求量增加，鲎血提取过度使得资源枯竭，造成鲎试剂检测成本增高，进而造成生态环境平衡的不可逆破坏，并且利用鲎试剂的检测方法检测时间长，因此研究能够替代天然鲎试剂的检测方法迫在眉睫[2-5]。

噬菌体展示技术就是在噬菌体表面展示出具有独立的空间结构以及生物活性的肽或者蛋白，用于筛选出与特异分子结合的肽或者蛋白质[6]。此方法目前已广泛用于新兴疫苗的研究、酶抑制剂的筛选、医学诊断和治疗药物的开发、蛋白质相互作用等[7-10]。

本文利用噬菌体展示技术筛选出能够与内毒素高效特异结合的十二肽，采用生物分子相互作用系统对其特异亲和性进行表征[11-12]；进而共价偶联乳胶微球，建立一种特异结合多肽检测内毒素的快速比浊定量检测方法，当样品中含有被测内毒素时，多肽能够与内毒素特异性结合，经紫外可见光分光光度计测定600nm处微球-多肽与内毒素复合物的吸光度值，经标准曲线能够计算获得被测内毒素的含量，对该方法进行评价，为内毒素检测提供新方法。

1 实验部分

1.1 实验材料

M13噬菌体随机十二肽库试剂盒（New England Biolabs），内毒素（0111：B4购自Sigma公司），内毒素标准品（中国食品药品检定研究院），鼠内毒素单克隆抗体（Abnova），PEG8000（Amresco），SA探针试剂盒（PALL），直径60mm培养皿（赛默飞），荧光酶标板（Greiner bio one），Fortbio分子互作仪（PALL）。

1.2 实验方法

1.2.1 噬菌体肽库的亲和筛选

将内毒素用包被液稀释至10μg/mL，取1.5mL包被塑料培养皿，4℃过夜。次日弃去包被液，加入封闭液4℃孵育2h。弃去封闭液，TBST洗涤平皿7次。取10μL原始库溶液用1M TBST稀释，加入平皿，室温轻轻摇动1h。移去肽库溶液，TBST洗涤平皿10次。加入1mL洗脱液，室温平缓摇动10min后将洗脱液收集，立即加入150μL中和液至中性。取1μL测滴度，其余加入20mL处于对数生长期的ER2738菌液中，37℃，220rpm/min孵育5h，特异性结合的噬菌体克隆得到扩增。应用PEG8000/NaCl沉淀噬菌体，在铺有IPTG和X-gal的平板上测定扩增的噬菌体的滴度。共进行3轮亲和筛选，逐步减少内毒素浓度，缩短噬菌体克隆与内毒素的结合时间，增加Tween20的浓度。

1.2.2 滴度测定

接种环挑取少量-70℃冻存的E.coli ER2738菌种，划线接种于LB琼脂板上，翻转平皿，37℃孵育过夜。挑取ER2738菌落至5mL LB培养基中，在225rpm/min，37℃培养至对数中期。分别加入200μL对数中期的菌液至10个EP管中。噬菌体洗脱物用LB培养液作梯度稀释，每个稀释度各取10μL分别加入装有菌液的EP管中，快速震荡，室温孵育5min。分别加入3mL顶层培养基至4mL EP管中，置于45℃恒温培养箱，将上述噬菌体与大肠杆菌混合液转移至其中，快速震荡，立即倒入37℃预热的LB/IPTG/X-gal/Tet培养皿中，将顶层培养基迅速摊开。冷却后，将培养皿倒置放于37℃恒温培养箱中过夜培养。次日观察培养板，计算噬菌体滴度。1.2.3 阳性噬菌体克隆融合肽单链DNA的提取和测序以及十二肽合成

取阳性克隆噬菌体上清100μL加到宿主菌中震荡培养，离心后从上清提取单链DNA，琼脂糖凝胶电泳显示1条单一明亮条带。将样品送至上海生物工程公司进行测序，并合成十二肽和生物素标记十二肽。

1.2.4 生物分子互作表征

（1）SA探针固定十二肽

用PBS溶解合成的生物素标记十二肽至终浓度为1mg/mL做为母液，采用PBST（PBS缓冲液+0.05%Tween-20）生物素标记十二肽母液分别稀释 至 100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL 和 12.5μg/mL，在黑色荧光微孔板的第一列中加入200μL PBST，在第二列中分别加入稀释的十二肽溶液200μL，37℃预热，反应温度30℃；SA光纤探针在第一列PBST中激活10min，然后插入到第二列与十二肽结合5min，最后插入到第一列PBST溶液中解离5min；整理分析数据，确定SA探针固定生物素标记十二肽的最佳浓度。

（2）生物素标记的十二肽与内毒素亲和性

生物素标记十二肽用PBST稀释至最佳固定浓度，采用PBST将内毒素分别稀释至1mg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL、31.25μg/mL和15.625μg/mL，在黑色荧光酶标板第一列和第三列加入200μL PBST，第二列加入200μL生物素标记十二肽溶液，第四列分别加入20μL梯度稀释的内毒素溶液并加入阴性对照PBST缓冲液；试剂37℃预热，反应温度30℃，SA光纤探针首先在第一列PBST中激活10min，随后在第二列中包被十二肽，然后在第三列PBST溶液中洗去非特异性吸附的生物素标记十二肽，随后在第四列包被的十二肽与内毒素结合5min，最后在第三列中解离5min，数据分析，获得十二肽与内毒素结合的动力学反应参数。

1.2.5 内毒素检测方法的建立

将合成的十二肽采用EDC/NHS共价偶联至乳胶微球（180nm），偶联产物与不同浓度内毒素混合后孵育，由于十二肽与内毒素能够发生特异性结合，能够形成复合物，使得溶液浊度随着内毒素浓度改变而改变，采用紫外可见光分光光度计在600nm波长下检测不同浓度内毒素-多肽-微球复合物吸光值，内毒素标准品浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，建立检测标准曲线，从而实现样本中内毒素的定量检测。

1.2.6 方法学回收率的评估

将内毒素标准品分别配制为0.05EU/mL、0.10EU/mL、0.20EU/mL、0.40EU/mL，采用上述建立的增强免疫比浊法检测已知浓度内毒素，测定浓度与实际浓度的比值即为该方法的加标回收率，用来评价检测方法的精密度与准确性。

1.2.7 方法学比较

461医院提供血清89份，利用市售鲎试剂内毒素检测试剂盒与本文建立的检测方法同时对血清样本进行检测，结果进行对比。

2 结果与讨论

2.1 高亲和性噬菌体克隆子的筛选

以内毒素为目标分子在十二肽库中进行亲和筛选，经过3轮洗脱，得到与内毒素亲和力高的噬菌体克隆子。经3轮筛选，结果如表1所示，十二肽库回收率从3×10-4提高至6.7×10-1。

表1 筛选噬菌体随机肽库回收率

2.2 阳性噬菌体克隆融合肽单链DNA的提取及序列测定

碘化物法提取经内毒素亲和性筛选获得的8个阳性噬菌体克隆单链DNA，琼脂糖凝胶电泳鉴定结果如图1所示，将该样本送公司测序，获得的DNA序列经DNASTAR软件综合分析，融合表达的十二肽库氨基酸序列为QVTPQVPRSTQM。

图1 碘化物法提取阳性噬菌体克隆单链DNA的鉴定结果

2.3 生物分子互作系统表征十二肽与内毒素亲和性

在SA探针表面包被不同浓度生物素标记十二肽，包被过程曲线如图2所示，曲线4为12.5μg/mL生物素标记十二肽，结合曲线上升速度均匀，且信号强度较高，因此为最适包被浓度。

包被有十二肽的SA探针在梯度稀释内毒素标准品溶液中进行结合与解离检测，测定曲线如图3所示，解离平衡常数KD即二者亲和力能够达到3.52×10-9，该数值越小，证明筛选出的十二肽与内毒素亲和力越强。利用上述方法分别对50mg/L的（1，3）-β-D-葡聚糖，海藻糖，葡萄糖与十二肽的结合/解离平衡常数进行测定，结果表明，筛选出的十二肽与（1，3）-β-D-葡聚糖，海藻糖，葡萄糖无亲和力。因此，筛选出的十二肽与内毒素的结合是高度专一的。

图2 SA探针表面包被不同浓度生物素标记十二肽过程曲线ρ十二肽（μg/ml）：A1：100.B1：50.C1：25.D1：12.5.

图3 十二肽与不同浓度内毒素标准品的结合与解离曲线ρ内毒素EU/mL：A4：0.48.；B4：0.24；C4：0.12.；D4：0.06；E4：0.03；F4：PBS；G4：空；H4：空

2.4 增强免疫比浊法内毒素检测标准曲线

分别配制内毒素标准品浓度为0.48EU/mL、0.24EU/mL、0.12EU/mL、0.06EU/mL、0.03EU/mL，用注射用水作为空白对照，分别向比色皿内加入300μL不同浓度内毒素标准品和3mL浓度为100μg/mL十二肽（PB缓冲液稀释），混匀，37℃反应5min。采用紫外-可见光分光光度计，在600nm波长下测定其吸光度，以内毒素标准品浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标，绘制检测标准曲线，如图4所示，内毒素在0.03～0.48EU/mL浓度范围内，内毒素标准品浓度与吸光度值呈正线性相关，线性方程为（y=0.0465ln(x)+0.1721），相关系数R2=0.9925，检测下限为0.03EU/mL，检测时间短，仅需5min。

图4 增强免疫比浊法内毒素定量检测标准曲线

2.5 方法回收率评价

如表2所示，取300μL配制的已知浓度内毒素标准品加入到3ml浓度为100μg/mL的十二肽溶液中，混匀，37℃反应5min，同一浓度内毒素反复测定5次。回收率公式结果表明，该检测方法回收率为96%～110%。

表2 回收率评估结果

2.6 方法学比较

采用市售鲎试剂内毒素检测试剂盒与本文建立的检测方法同时对50例患者血清和39例健康病人血清中内毒素含量进行测定，检测结果如表3所示，两种检测方法的阳性结果符合率为98%（49/50），阴性结果符合率为100%（39/39）。

表3 两种内毒素的检测方法对比

3 结论

本文成功利用噬菌体展示技术筛选出能够与内毒素结合的十二肽，并通过分子互作技术验证了该十二肽与内毒素具有高度亲和性，解离平衡常数KD=3.52×10-9mol/L。将十二肽与乳胶微球偶联后建立了增强免疫增强免疫比浊法检测内毒素的新方法，内毒素标准品在0.03～0.48EU/mL浓度范围内，其浓度与吸光度值呈正线性相关，相关系数R2＞0.99，检测下限达到0.03EU/mL，该方法的批间和批内的变异系数小于5%，该方法回收率为96%～110%，与市售鲎试剂内毒素检测试剂盒同时测定血清样本，测定结果阳性符合率为98%，阴性符合率为100%。

增强免疫比浊法内毒素检测方法采用噬菌体展示技术筛选出与内毒素具有高结合性的十二肽，无需利用天然鲎试剂，能够降低检测成本，保护自然环境生态平衡；并且该方法步骤简单，检测时间短，仅需5min即可完成样本测定，符合临床快速检测需求，乳胶微球在免疫比浊中起到增强效应，提高了检测灵敏度，同时该方法容易实现高通量，弥补了国内外检测方法的不足，预期能够在医疗器械，食品药品，医疗诊断等领域发挥重要作用。