UPLC法测定灵芝子实体中11种三萜酸含量

逄世峰，闫梅霞，王佳，崔丽丽，马莹，朴承熙，崔东河，王英平※

（1.中国农业科学院特产研究所，长春 130112；2.集安人参研究所，通化 134200）

灵芝为担子菌纲多孔菌科（Polyproraceae）灵芝属（Ganoderma）真菌赤芝〔Ganoderma lucidum（Leyss.ex Fr.）Karst.〕和紫芝（G.japonicum Zhao Xu et Zhang）的干燥子实体[1]。灵芝含有多种化学成分，其中三萜酸类化合物为主要有效成分之一，具有抗肿瘤、保肝、解毒、抗衰老等多种药理作用[2-4]。目前，灵芝中三萜酸的测定多采用高效液相色谱（HPLC）方法，但该法分析时间较长，一般60 min以上，而且检测化合物较少[5-6]。本研究采用超高效液相色谱法（UPLC）测定灵芝中赤芝酸C、赤芝酸N、灵芝酸G、灵芝烯酸B、灵芝酸B、脱乙酰灵芝酸F、灵芝酸A、赤芝酸A、灵芝酸D、赤芝酸D、灵芝酸F 含量，以期为灵芝中这11种三萜酸含量的测定提供一种准确、灵敏、快速的分析方法，为灵芝质量控制提供参考依据。

1 仪器与试药

超高效液相色谱仪ACQUITY（Waters 公司）；赤芝酸C、赤芝酸N、灵芝酸G、灵芝烯酸B、灵芝酸B、脱乙酰灵芝酸F、灵芝酸A、赤芝酸A、灵芝酸D、赤芝酸D、灵芝酸F（四川维克奇生物科技有限公司）；乙腈（色谱纯，Fisher 公司）；水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

灵芝栽培于中国农业科学院特产研究所左家试验基地农业部长白山野生生物资源观测站，经中国农业科学院特产研究所许世泉副研究员鉴定为多孔菌科灵芝属真菌赤芝（G.lucidum）的子实体。将灵芝切片，于50 ℃烘干至恒重，中药粉碎机粉碎，待用。

2 试验方法

2.1 对照品溶液制备

分别精密称取赤芝酸C、赤芝酸N、灵芝酸G、灵芝烯酸B、灵芝酸B、脱乙酰灵芝酸F、灵芝酸A、赤芝酸A、灵芝酸D、赤芝酸D、灵芝酸F 对照品5.08 mg、4.60 mg、4.56 mg、4.17 mg、4.56 mg、3.83 mg、4.82 mg、5.55 mg、4.82 mg、5.01 mg、5.56 mg，置于25 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度。

2.2 供试品溶液制备

取样品粉末1.0 g，加乙醇20 mL，室温超声（功率500 W，频率40 kHz）提取30 min，过滤，提取2 次，合并提取液，浓缩至10 mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀，静置。吸取上清液，过0.22m PTFE滤膜，待进样分析。

2.3 色谱条件[7]

色谱柱：ACQUITYUPLC HSST3（2.1mm×50mm，1.7m）；流动相：乙腈-0.03%磷酸水溶液（梯度洗脱：0～13 min 19%～29.4%乙腈，13～16 min 29.4%～45%乙腈）；流速：0.5 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：2L；检测波长：258 nm。

3 结果

3.1 线性关系

将混合对照品溶液分别用甲醇稀释，制成一系列浓度的混合标准品溶液，依次注入超高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积。以峰面积为纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程，结果见表1。

表1 线性方程Table 1 Linear equation

3.2 精密度试验

取同一浓度的对照品溶液，按“2.3”项下色谱条件，连续进样6 次，进样量2µL，测定峰面积。赤芝酸C、赤芝酸N、灵芝酸G、灵芝烯酸B、灵芝酸B、脱乙酰灵芝酸F、灵芝酸A、赤芝酸A、灵芝酸D、赤芝酸D、灵芝酸F的RSD分别为0.89%、1.08%、1.95%、1.78%、1.41%、1.82%、1.69%、1.38%、0.93%、0.76%、0.68%，表明仪器精密度良好。

3.3 稳定性试验

取同一灵芝供试品溶液，室温下放置，分别于0 h、6 h、12 h、18 h、24 h 按上述色谱条件进样分析。得赤芝酸C、赤芝酸N、灵芝酸G、灵芝烯酸B、灵芝酸B、脱乙酰灵芝酸F、灵芝酸A、赤芝酸A、灵芝酸D、赤芝酸D、灵芝酸F 峰面积的RSD 分别为2.57%、2.79%、3.22%、3.93%、2.58%、3.24%、1.36%、1.51%、2.53%、3.36%、1.87%，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

3.4 重复性试验

取同一份灵芝样品，精密称取6 份，按供试品溶液的制备方法处理，进样分析。测得赤芝酸C 平均含量为0.108mg/g、RSD3.75%，赤芝酸N 平均含量为0.097mg/g、RSD 4.97%，灵芝酸G 平均含量为0.43 mg/g、RSD 2.33%，灵芝烯酸B 平均含量为0.147 mg/g、RSD 3.94%，灵芝酸B 平均含量为0.537 mg/g、RSD 2.85%，脱乙酰灵芝酸F 平均含量为0.757 mg/g、RSD 2.02%，灵芝酸A 平均含量为3.727 mg/g、RSD 1.48%，赤芝酸A 平均含量为0.867 mg/g、RSD 1.76%，灵芝酸D 平均含量为1.963 mg/g、RSD 2.06%，赤芝酸D 平均含量为0.257mg/g、RSD2.25%，灵芝酸F平均含量为1.027mg/g、RSD 1.12%，表明重复性良好。

3.5 加样回收率试验

精密称取已知含量的样品粉末6 份，添加一定量的三萜酸对照品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下测定，结果见表2。

表2 加样回收率Tab.2 Recovery of sample （n=6）

3.6 样品测定

按照“2.2”项下供试品溶液的制备方法操作，按照“2.3”项下色谱条件测定样品。结果见表3，色谱图见图1。

图1 标准品和样品UPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances and sample

表3 灵芝中11种三萜酸含量Tab.3 Content of eleven triterpenoid acids in G.lucidum

由图1 和表3 可知，灵芝中含有多种三萜酸类化合物，以灵芝酸A、灵芝酸D、灵芝酸F 含量最高。

4 结论

考察了BEH C18 和HSS T3 2 种型号色谱柱的分离效果，各标准品基本均达到基线分离。采用BEHC18色谱柱分离时，样品在灵芝酸A 处色谱峰所占比例较大，说明有其他物质混杂；采用HSST3 色谱柱分离时，灵芝酸A 处色谱峰所占比例变小，故选择HSS T3 色谱柱进行测定。由紫外光谱图可知，11 种三帖酸在248～264nm之间有最大吸收（图2），故选择258 nm作为检测波长。本方法简便、稳定，可在16 min内完成11 种三萜酸的定量分析，为灵芝质量评价提供参考依据。

图2 11种三萜酸光谱图Fig.2 Spectrogram of eleven triterpenoid acids