肝纤维化动物模型研究进展

梁丽清，苏华珍，陈少锋

（1.广西国际壮医医院，广西 南宁 530201；2.桂林医学院附属医院，广西 桂林 541001）

肝纤维化是由病毒感染、酒精、药物、毒物、寄生虫、胆汁淤积和代谢性疾病等因素刺激引起肝脏“损伤-修复”的病理过程。肝纤维化进一步发展可引起肝小叶改变、假小叶与结节形成，最终可发展为肝硬化或肝癌。目前的研究证实肝纤维化过程具有可逆性［1］，对肝纤维化进行早干预、早治疗，对预防肝硬化及肝癌的发生发展具有重要的意义。肝纤维化模型的建立，对研究肝纤维化发生机制及病理过程有着极大的作用，也是研究肝纤维化治疗药物的基础。目前，已有许多国内外的学者对肝纤维化动物模型进行研究，本文对目前常用的几种肝纤维化动物模型进行综述。

1 化学药物诱导的肝纤维化动物模型

化学药物或毒物可诱导肝纤维化的发生，大剂量或长期给予大鼠具有肝毒性的化学药物或毒物，可致使机体发生慢性肝损害而造模。常用的造模药物有四氯化碳（CCl4）、二甲基亚硝胺（DMNA）、硫代乙酰胺（TAA）等。

1.1 CCl4诱导的肝纤维化模型 CCl4构建的动物肝纤维化模型是国内外广泛应用的经典研究方法。四氯化碳作为一种常用的有机溶剂，对肝脏具有毒性作用，可引起肝细胞的坏死，CCl4可通过升高NO（一氧化氮）而增加炎症介质释放和增加氧化应激，增加TGF-β1的表达而诱导HSC（肝星状细胞）的激活，促进HSC的增殖，增加肝脏血小板源性生长因子-BB（PDGF-BB）、肿瘤坏死因子（TNF-α）表达而使HSC活化，细胞外基质增加从而引起肝纤维化［2］。CCl4诱导的肝纤维化模型一般采用20%～60%［3-5］的四氯化碳花生油、橄榄油、茶油溶液，造模途径有口服、吸入、腹腔注射及皮下注射等，给药剂量和给药途径不同，成模的时间不同，一般为8周～4个月不等。魏晓光等［6］使用SD大鼠，以40%CCl4橄榄油混悬液按照1.0 ml/kg腹腔注射，每周3次，共8周，有效建立大鼠肝纤维化模型，建模成功率达88.3%。许建明等［7］给予昆明种小鼠皮下注射5 ml/kg 20%CCl4茶油溶液，每5天1次，连续3个月，可导致小鼠肝纤维化的形成，且有较明显的肝纤维化的阶段性变化。CCl4造模法价格低廉，操作简便，病变过程稳定，病理结果可靠，在形态学病理学方面与人肝纤维化具有相似性，适用于大鼠、小鼠等动物的肝纤维化模型建立，缺点是造模时间较长，CCl4溶液剂量若把握不当，可能引起较高的死亡率。

1.2 DMNA诱导的肝纤维化模型 二甲基亚硝铵具有显著的肝毒性，它可在体内代谢为乙醛等高反应活性的代谢物，可以与蛋白质、巯基基团、游离氨基酸等反应，破坏这些大分子的结构，与细胞膜或线粒体膜表面膜蛋白结合形成复合物，从而造成肝细胞坏死、细胞外基质进行性增加而造成肝纤维化［8］。DMNA诱导的肝纤维化模型常用腹腔注射0.5%～1%DMNA溶液，一般模型建立约需4周。DMNA建立肝纤维化模型相对稳定，不易自愈。Risteli等［9］研究发现由DMNA造成的肝纤维化可在停药后维持约2个月，是研究肝纤维化治疗药物的一个较好的模型。冯琴等［10］使用Wistar大鼠，每周3次腹腔注射0.5%DMNA溶液2 ml/kg，持续3周，第4周连续3天的剂量分别为平时剂量、2/3平时剂量、1/2平时剂量。造模后，大鼠出现典型的肝纤维化病理改变。贺文广等［11］给予Wistar大鼠腹腔注射 1%DMNA生理盐水溶液，剂量为10 mg/kg，隔日1次，每周3次，共4周，结果成功建立肝纤维化模型，造模存活率为86.4%。DMNA为一级诱癌剂，在实验过程中需做好安全防护。

1.3 TAA诱导的肝纤维化模型 硫代乙酰胺作为一种肝毒剂，可引起肝纤维化，甚至肝硬化。TAA能够作用于肝细胞DNA、RNA和蛋白质相关的合成酶，产生毒性作用，并能够影响肝脏代谢，引起代谢紊乱，甚至肝坏死［12］。TAA制备肝纤维化模型，成模率高，造模期间并发症少，死亡率低，且形成的肝纤维化较难自愈。一般采用灌胃、皮下注射和腹腔注射，2～3次/周，造模周期一般大于4周。薛改等［13］使用质量浓度为3%的TAA对SD大鼠进行灌胃，剂量为160 mg/kg，隔天1次，灌胃6周后，处死大鼠取血清和肝脏，分别进行肝功能及病理检测，留取部分成模大鼠，停止灌服TAA 11周后，取肝组织进行HE染色，观察肝纤维化自愈情况，发现TAA灌胃6周后，肝纤维化形成率为100%，停用TAA 11周后，与11周前相比，HE染色显示肝纤维化程度未见显著变化。景晶等［14］以3%TAA生理盐水溶液，150 mg/kg每周2次腹腔注射SD大鼠，连续12周，病理可见多数肝小叶结构被破坏或消失，由汇管区和中央静脉伸出粗大胶原条索把肝小叶分割，包绕肝小叶，肝细胞索排列混乱，纤维隔内有大量成纤维细胞浸润。何丽明等［15］以200 mg/kg硫代乙酰胺溶液腹腔注射ICR小鼠，隔天1次，连续7周，模型组小鼠可见肝小叶结构破坏严重，肝索排列紊乱，形成假小叶，有炎性细胞浸润和胆管细胞增生。除上述方法外，还有二乙基亚硝胺［16］及半乳糖胺［17］诱导的肝纤维化造模法。

2 酒精诱导的肝纤维化模型

在体内，90%～95%的乙醇会被肝脏代谢，乙醇可使肝脏的氧消耗增加，并减少小叶中心肝细胞氧供，引起小叶中心肝细胞的炎症和坏死，促发肝纤维化；另外，乙醇在肝脏代谢产生的毒性代谢产物乙醛对肝脏产生直接损害，乙醛可直接刺激胶原蛋白的合成，促进肝纤维化的发生，在肝脏还可使辅酶Ⅰ（NAD）转变为还原性辅酶Ⅰ（NADH）从而影响三羧酸循环，使脂肪氧化减弱，脂肪酸形成增多，形成脂肪肝，最终形成肝纤维化。酒精诱导的肝纤维化模型方法简单，价格低廉，但若灌胃操作不当易引起动物死亡，需要掌握灌胃量及操作技术。石晓等［18］采用Wistar大鼠每日灌胃乙醇进行造模，酒精浓度采取逐级递增的方法:第 1～4周 4.5 g/kg，第 5～8周6.5 g/kg，第9～12周9.0 g/kg，第13～24周9.6 g/kg，造模持续24周后出现肝纤维化。黄静等［19］给大鼠灌服白酒-玉米油-吡唑混合液，每日1次（其中56度白酒5 g/kg，玉米油2 ml/kg，吡唑27.2 mg/kg），并给予高脂饲料（87.5%基础饲料，10%猪油，2%胆固醇）饲养，连续16周后，大鼠肝脏组织胶原纤维增生明显，汇管区、中央静脉及肝实质内有大量的胶原沉积，并进入肝小叶形成不完全间隔。

3 免疫性肝纤维化模型

免疫性肝纤维化的原理主要是利用异体抗原进入体内引起机体免疫应答，产生抗体，继而形成大量免疫复合物，在中央静脉、汇管、肝窦、血管壁沉着，引起炎症反应，刺激胶原形成，进而引起肝纤维化。常用猪血清［20］、牛血清［21］、血吸虫病［22］等进行模型建立。该造模方法适合于免疫方面肝纤维化的机制研究及药物筛选研究，但造模周期长，死亡率高，并有自愈倾向。刘瑛等［23］给SD大鼠使用猪血清进行腹腔注射，每周2次，剂量为0.5 ml/只，共15周，可见模型组纤维组织明显增生，纤维间隔增多增宽，并向肝小叶内伸展，交错呈网状结构，将肝小叶分割，形成完全或不完全假小叶，肝细胞明显变性肿胀，部分有点状坏死，汇管区扩大，伴大量炎性细胞浸润。刀豆蛋白也可诱导免疫性肝纤维化，使用刀豆蛋白（10 mg/kg）给小鼠尾静脉注射，2次/周，8周后肝小叶结构破坏，可见明显纤维间隔形成［24］。

4 复合因素导致的肝纤维化模型

由于单因素建立肝纤维化模型存在一定的弊端，如造模周期长，某些肝毒性物质毒性大易造成动物死亡等，复合因素造模可提高造模成功率，并且可以缩短造模周期，目前复合因素造模法也是一种比较常用的方法。如高脂、酒精刺激和猪血清腹腔注射造模［25］，喂食酒精、玉米油、吡唑结合微量CCl4腹腔注射［26］，背部皮下注射CCl4并以5%乙醇为饮用水［27］等方法。

5 胆汁淤积性肝纤维化模型

胆汁淤积性模型是人为造成的胆管阻塞，胆汁淤积，肝细胞浆内胆色素沉积，从而引起肝细胞缺血、变性和坏死，纤维组织增生进而引起肝纤维化。该方法建立的模型周期短，炎症反应轻微，实验中无对人和动物有毒的物质，是比较理想的研究肝纤维化机制、筛选抗肝纤维化治疗药物的模型。但该模型对操作技术要求较高，若结扎的胆管再通，可能造成胆汁过度淤积引起动物死亡。目前主要有胆总管结扎法［28］、逆行性注入N-丁基-2-氰基丙烯酸盐加胆管结扎［29］等。刘迎春等［30］采用SD雄性大鼠，腹腔麻醉后分离胆管，以丝线两处剪断1 cm结扎胆管，第4周可见大量胶原组织沉积，纤维增生明显，胶原纤维从汇管区及中央静脉周围向肝小叶内延伸，第6～8周肝组织结构破坏更严重，肝细胞大片状变性、坏死及空泡变，见大量炎细胞浸润，大量胶原纤维从汇管区及中央静脉周围向肝小叶内延伸，可见假小叶形成，病理学分级为S3～S4。

6 肝缺血再灌注诱导的肝纤维化模型

肝缺血再灌注诱导的肝纤维化模型是利用肝缺血再灌注操作形成的一种新型肝纤维化模型，该方法建立的模型符合临床实际，在严重肝外伤、肝移植、休克复苏时均不可避免出现肝缺血再灌注损伤、多种细胞因子释放、炎症细胞浸润等过程促进肝纤维化的发生，建立肝缺血再灌注损伤肝纤维化模型，可为这方面的研究提供一种新的方向。刘俊平等［31］用无创动脉夹夹闭大鼠肝左叶和中叶的肝动脉、门静脉，造成70%的肝脏缺血，夹闭90 min后，开夹，继续饲养4周后大鼠肝小叶结构紊乱，肝细胞肿胀、胞质透亮、气球样变性、坏死，部分有炎性细胞浸润，汇管区结缔组织有不同程度增生。

7 讨 论

除上述肝纤维化模型外，近些年还常用的有脂肪性肝纤维化模型［32］、乙肝病毒转基因模型［33］、放射性肝纤维化模型［34］等。这些动物模型各有特点，发病机制亦不尽相同，在某些方面与人类肝纤维化机制具有相似之处，在研究过程中可根据需要进行选择，但目前尚未有与人类肝纤维化疾病反应完全相同的动物模型，这也是学者们研究的难点，需要继续进行更加深入的研究。