海南南繁区水稻纹枯病菌的遗传多样性与致病力分化

朱名海 彭丹丹 舒灿伟 周而勋



海南南繁区水稻纹枯病菌的遗传多样性与致病力分化

朱名海 彭丹丹 舒灿伟 周而勋*

(华南农业大学 农学院/广东省微生物信号与作物病害重点实验室, 广州 510642;*通讯联系人, E-mail: exzhou@scau.edu.cn)

【目的】为明确南繁区水稻纹枯病菌(AG-1 IA)的遗传分化及遗传多样性与致病力的关系，【方法】采用AFLP分子标记技术和离体叶片接种法对南繁核心区(三亚、乐东、陵水)和非核心区(琼中、屯昌和定安)共60株水稻纹枯病菌的遗传多样性、遗传结构和致病力分化进行了测定，并分析了遗传多样性与致病力之间的关系。【结果】聚类分析结果表明，核心区菌株的遗传多样性相对更高；群体遗传结构分析表明，核心区群体的多态性位点百分率(PPL)、Nei基因多样性指数()、Shannon信息指数()和基因流(m)分别为 82.24%、0.1932、0.3062和2.5627，高于非核心区群体的67.49%、0.1535、0.2447和0.9365；而核心区群体的基因分化系数(st)为0.1633，低于非核心区群体的0.3481。【结论】核心区菌株的遗传变异程度比非核心区菌株高；核心区不同群体间存在较多的基因交流，而非核心区菌体间的基因交流较少，但遗传变异均主要来自于群体内；总体而言，核心区菌株的遗传分化程度更高。菌株的致病力及其与菌株遗传多样性的相关性分析表明，核心区菌株以中等致病型为主，而非核心区菌株则以中、强致病型为主，但与菌株的AFLP谱系之间的相关均未达显著水平。

南繁区；水稻纹枯病菌；遗传多样性；遗传结构；致病力分化；AFLP

海南南繁区位于我国海南岛南部的三亚市、陵水县、乐东县和保亭县等地，该地区得天独厚的光温气候资源对我国水稻、玉米和棉花等农作物的繁育起到了巨大的作用，是我国最具影响力的农业科技试验基地，所以也叫国家南繁育种基地。尤其是在目前世界种业竞争激烈的情况下，南繁区对加快我国农作物育种进程起到了巨大的推动作用，被誉为“中国种业科技硅谷”[1]。

水稻纹枯病是最具毁灭性的水稻病害之一[2]，随着水稻种植方式的改变、矮秆高产品种的推广以及化肥施用量的增加，为害程度不断加重。根据中国植物保护学会微信公众号的报道，2018年我国水稻纹枯病总体偏重发生[3]。立枯丝核菌(Kühn)是一种土传性的、腐生能力很强的病原真菌，不产生分生孢子。由于该真菌是一个庞大的复合种，所以种下要进行融合群分类。到目前为止，该菌被划分为14 个融合群(anastomosis group, AG)，共18个融合亚群[4]。水稻纹枯病菌是其中的一个融合亚群，即AG-1 ⅠA，主要是以菌丝体或菌核形式在土壤中存活并引起初侵染[5]。对该菌的遗传多样性、遗传结构及遗传多样性与致病力之间的关系进行研究，是了解其演变规律，准确预测水稻纹枯病发生和流行趋势的重要基础。

近年来，各种分子标记技术在植物病原真菌的遗传多样性研究上发挥了巨大的作用。这些分子标记技术主要有RFLP[6]、RAPD[7]、SSR[8]、ISSR[9]、AFLP[10-12]和SRAP[20]等。AFLP是一种既可靠又高效的分子标记技术，具有多态性高、DNA用量少、检测效率高、重复性好、对DNA模板浓度变化不敏感等优点[12]。Taheri等[10]对从印度水稻分离得到的110个立枯丝核菌菌株(其中，AG-1 ⅠA菌株96个，AG-1 ⅠB菌株1个，AG-1 ⅠC菌株2个和AG-Bb菌株11个)进行了AFLP分析，发现聚类分析的结果与这些菌株的融合群属性一致；进一步的分析表明，影响水稻纹枯病菌(AG-1 ⅠA)群体遗传结构的主要因素是地理来源，寄主品种对此影响不大。范文艳等[11]对黑龙江省13个水稻种植地区共29个水稻纹枯病菌进行了AFLP分析和致病力测定，测定结果表明黑龙江省的水稻纹枯病菌具有较明显的致病性分化，并且病原菌的遗传谱系与致病性鉴定之间存在一定相关性。

农作物品种在南繁区繁育过程中，大陆与南繁区之间的水稻种子或无性繁殖材料调运频繁。为了研究种子或无性繁殖材料上所携带的病原菌对南繁区水稻纹枯病菌的遗传多样性和致病力的影响，本研究以分离自南繁核心区(三亚市、陵水县、乐东县和保亭县)和非核心区(琼中县、屯昌县和定安县)的水稻纹枯病菌为研究材料，对其遗传多样性、遗传结构及其致病力之间的关系进行研究，了解南繁区水稻纹枯病菌遗传本质上的差异及其致病力分化的现状，为南繁区水稻繁育及其纹枯病防治提供理论依据。

1　材料与方法

1.1　供试菌株

分别于2014年3、5、6和10月分4批次从南繁核心区的三亚市、陵水县和乐东县以及非核心区的琼中县、屯昌县和定安县的水稻田中采集表现典型水稻纹枯病症状的病鞘或病叶100多份，按照周而勋等[13]的快速简便分离法进行病原菌的分离、纯化，初步获得病原菌菌株。这些菌株经细胞核染色[14]和融合群测定[15]最终确定为立枯丝核菌()AG-1 ⅠA融合亚群菌株(即水稻纹枯病菌)。最后，每县(市)选取10个代表菌株用于遗传多样性和致病力分析，供试菌株的详细情况见表1。

1.2　菌丝收集与DNA提取

挑取新活化的水稻纹枯病菌菌丝块，接种到装有100 mL PDB培养基(马铃薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，去离子水1000 mL)的500 mL三角瓶中，25℃、150 r/min下摇菌培养3～5 d后抽滤收取菌丝，用于提取DNA(采用OMEGA SP Fungal DNA Mini Kit)。

表1  海南南繁核心区和非核心区水稻纹枯病菌

表2  AFLP所用接头和引物

1.3　AFLP的接头和引物

AFLP接头和引物的序列详情见表2，由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。

1.4　AFLP分析

1.4.1基因组DNA的酶切和连接

限制性内切酶R I、I和T4连接酶均购自NEB公司，酶切体系为20 μL，DNA模版量为 300.0 ng，37℃下酶切3 h；连接体系为25 μL，I 接头和R I 接头的浓度分别为5 μmol/L和50 μmol/L，16℃下连接过夜。

1.4.2预扩增和选择性扩增

PCR所用的预混液购自TaKaRa公司。预扩增体系为25 μL，其中，连接产物5μL，10 μmol/LR I和I预扩增引物各1 μL，混匀后进行常规PCR；选择性扩增体系为25 μL，其中，预扩增20倍稀释产物5 μL，10 μmol/LRⅠ和Ⅰ选择性扩增引物各1 μL，混匀后进行降落(Touch-down) PCR。

1.4.3变性聚丙烯酰氨凝胶电泳及银染检测

6%变性聚丙烯酰胺凝胶80W恒功率电泳2 h，采用Brant等[16]的方法(略有改动)进行银染检测，胶板晾干后拍照保存。

1.5　致病力测定

水稻纹枯病菌的致病力测定以及致病力分级标准参照周而勋等[15]的离体叶片接种法。供试水稻为中感水稻品种Jasmine 85。

1.6　数据处理

1)用Excel 软件对原始数据进行初步处理，并用SPSS 17中的Duncan新复极差法对菌株的致病力进行差异显著性分析。

2)根据扩增带的有无对电泳图谱进行读取，取得“01”数据矩阵表；用NTSYSpc 2.1软件进行聚类分析；用POPGENE32 1.32软件计算相关的遗传多样性指标：多态性位点百分率、Nei基因多样度、Shannon信息指数、群体总基因多样性t、群体内基因多样性s、基因分化度st、基因流m、遗传一致性和遗传距离。

2　结果与分析

2.1　不同引物组合对水稻纹枯病菌DNA扩增的多态性

本研究从64对随机引物组合中筛选了8对条带较丰富且多态性较高的引物组合用于AFLP分析，分别为E1/M2、E2/M3、E2/M7、E3/M2、E3/M4、E6/M3、E6/M5和E6/M8。扩增片段的长度多为100~600 bp(图1)，共扩增出366条条带，平均每对引物组合可检测到45.75条条带，其中331条具有多态性，平均每对引物组合可检测到41.38条多态性条带，多态性条带百分率为90.44%(表3)。可见南繁核心区和非核心区水稻纹枯病菌个体间存在丰富的遗传多样性。

M－分子标记。

Fig. 1. AFLP amplification results ofAG-1 IA with the primer combination E3/M2.

2.2　遗传多样性分析

在相似系数为0.82处，从上到下依次可将它们分为9组。核心区和非核心区的水稻纹枯病菌菌株在4个谱系中有交叉分布，说明核心区和非核心区菌株之间存在一定的基因交流，亲缘关系较接近；核心区菌株一共分布在9个谱系里，而非核心区菌株仅分布在4个谱系中，表明核心区菌株间的遗传分化程度更高；其中，陵水菌株一共分散在6个谱系里，说明该地区的菌株遗传分化程度最高，而定安菌株仅分布在一个谱系里，说明定安地区的菌株遗传分化程度最低(图2，表4)。

表3  南繁核心区和非核心区水稻纹枯病菌AFLP引物组合的扩增结果

2.3　遗传结构分析

由表5可知，南繁区水稻纹枯病菌群体的多态性位点百分率(PPL)为90.44%。其中，核心区群体的PPL值为82.24%，高于非核心区群体的67.49%，6个群体的PPL值为16.39%~74.59%，6个群体的PPL值大小代表遗传变异的程度为陵水＞屯昌＞三亚＞乐东＞琼中＞定安。南繁区水稻纹枯病菌群体总的值为0.3009，其中，核心区群体的值为0.3062，也高于非核心区的0.2447，6个群体间的值为0.0761~0.3250，根据值遗传变异由高到低的顺序依次为陵水＞三亚＞屯昌＞乐东＞琼中＞定安；南繁区水稻纹枯病菌群体总的值为0.1869，其中，核心区群体的值为0.1932，也高于非核心区的0.1535，各群体的值为0.0503~0.2082，6个群体的值依次为陵水＞三亚＞屯昌＞乐东＞琼中＞定安。以上各项遗传多样性参数的比较分析结果表明，南繁核心区和非核心区水稻纹枯病菌的遗传多样性在各群体间有一定的差异，核心区水稻纹枯病菌群体的遗传多样性分化高于非核心区。

由表6可知，南繁区水稻纹枯病菌群体总的基因分化度[st=(t−s)/t]为0.2997，其中，核心区水稻纹枯病菌群体的Gt为0.1633，非核心区水稻纹枯病菌群体的st为0.3481；南繁区水稻纹枯病菌群体总的基因流[m=0.5(1−st)/st]为1.1682。其中，核心区水稻纹枯病菌群体的m值为2.5627，非核心区水稻纹枯病菌群体的m值为0.9365，表明核心区水稻纹枯病菌群体间有较多基因交流，非核心区水稻纹枯病菌群体间的基因交流则相对较少，群体间的遗传分化相对较大，但遗传变异均主要发生在群体内。

由表7可知，遗传一致性n最高(遗传距离最小)的群体为陵水和屯昌，遗传一致性n最低(遗传距离最大)的群体为三亚和定安。基于遗传一致性的群体聚类分析(图3)表明，在遗传一致性(n)值为0.9360时，非核心区的屯昌群体与核心区各群体聚为一组，非核心区的琼中群体和定安群体各聚为一组，进一步证明核心区群体的遗传分化程度大于非核心区的。

右侧编号为水稻纹枯病菌菌株编号。

Fig. 2. Clustering dendrogram ofAG-1 IA from the core and non-core regions of South China Crop Breeding Area in Hainan Province.

表4  海南南繁核心区和非核心区水稻纹枯病菌AFLP谱系分析

表5 海南南繁核心区和非核心区水稻纹枯病菌不同群体的遗传多样性分析

表6  海南南繁核心区和非核心区水稻纹枯病菌群体的遗传分化和基因流

表7  海南南繁核心区和非核心区水稻纹枯病菌群体的遗传一致性和遗传距离

左下角为遗传距离，右上角为遗传一致性。

The lower left corner is the genetic distance, and the upper right corner is the genetic consistency.

2.4　致病力测定结果

由表8可知，所有菌株对Jasmine 85水稻品种均有一定的致病性，同时各菌株之间又存在一定的致病力分化。致病型的统计分析(表9)表明，核心区和非核心区菌株的致病型有一定的差异，核心区菌株强、中、弱类型的出现比例分别为16.7%、63.3%、20.0%；而非核心区菌株强、中、弱类型的出现比例分别为36.7%、46.7%、15.7%，说明核心区菌株以中等致病型为主，而非核心区菌株则以中、强致病型为主。强致病力菌株中，屯昌地区出现的比例最高，为50.0%，三亚地区未发现此类型菌株；中等致病型菌株中，乐东地区出现的比例最高，为80.0%，屯昌地区出现的比例最小，为20.0%；弱致病型菌株中，三亚和屯昌地区出现的比例最高，为30.0%，琼中地区未发现此类型菌株。同时，由上述表4的结果也可以看出，菌株AFLP谱系与其致病力相关未达显著水平。

图3 基于Nei遗传一致性的南繁核心区和非核心区水稻纹枯病菌群体聚类分析结果

Fig. 3. Clustering dendrogram ofAG-1 IA from the core and non-core regions of South China Crop Breeding Area based on Nei’s genetic consistency.

表8 海南南繁核心区和非核心区的水稻纹枯病菌致病力

a：致病型。强－病级值在4.0以上；中－病级值为3.0~4.0；弱－病级值在3.0以下。b－表中数据采用Duncan新复极差法(DM)进行差异显著分析。不同小写字母和大写字母分别表示处理间在5 % (=0.05) 或1% (=0.01)水平上差异显著。平均数±标准差。

a, Pathotypes. Strong, The value of disease grade is above 4.0; Medium, The value of disease grade is between 3.0 and 4.0; Weak, The value of disease grade is under 3.0. b, Data in the table were analyzed with the Duncan’s multiple range test, different lowercase and uppercase letters in the same column are significantly different among treatments at 5% (=0.05) or 1% (=0.01) levels, respectively. Average±standard deviation.

表9 海南南繁核心区和非核心区水稻纹枯病菌的致病型

3　讨论

3.1　南繁区水稻纹枯病菌DNA的AFLP分析

本研究一共筛选出 8 对引物组合用于南繁核心区和非核心区60个水稻纹枯病菌的AFLP分析，不同引物的多态性条带百分率为75.00%~ 97.37%，所有引物的总多态性条带百分率为90.44%，表明菌株间存在较高的遗传多样性。

3.2　南繁区水稻纹枯病菌的遗传多样性分析

南繁核心区和非核心区水稻纹枯病菌的聚类分析表明，核心区菌株一共分布在 9 个谱系里，而非核心区菌株只分布在 4 个谱系中，表明核心区菌株间的遗传分化程度更高；其中，定安县的菌株只分布在一个谱系里，说明该地区的菌株遗传分化程度最低。出现这种现象的原因与南繁区水稻种子的复杂来源及其携带的病原菌有关，因为核心区的水稻种子来源相对非核心区更复杂，而离热带气候区稍远的定安县由于不太适合水稻种子的冬春繁殖要求，故主要为当地的水稻品种，所以该地区水稻纹枯病菌的遗传分化程度便出现了较低的现象。

3.3　南繁区水稻纹枯病菌的遗传多样性与致病力相关性分析

南繁核心区和非核心区 60 个水稻纹枯病菌菌株聚类群的划分与这些菌株的致病力划分的比较分析表明，核心区和非核心区水稻纹枯病菌的遗传谱系与其致病力强弱之间相关不显著；这与陈涛[17]、黄雯雯[18]、吴荷芳[19]和张优[20]等的研究结果一致；但范文艳等[11]对黑龙江省水稻纹枯病菌的致病力分化与AFLP分析研究却发现，病原菌遗传聚类群的划分与菌株的致病类型之间存在一定的相关性。因此，水稻纹枯病菌的致病力与其遗传宗谱之间的关系尚无统一的结论。诚然，由于目前有关水稻纹枯病菌的遗传谱系与其致病力相关性的报道中，大部分研究均认为水稻纹枯病菌的遗传谱系与其致病力之间无明显的相关性，可见水稻纹枯病菌的遗传谱系与其致病力之间的关系较复杂，而不是简单的正相关关系，需要进行进一步的探究。

3.4　南繁区水稻纹枯病菌的群体遗传结构分析

南繁核心区和非核心区水稻纹枯病菌群体的遗传多样性指数分析表明，南繁核心区群体的遗传分化程度高于非核心区，这可能与核心区相对更复杂的水稻品种来源以及水稻纹枯病菌菌核较低的迁移能力有关。

南繁核心区和非核心区水稻纹枯病菌各群体的遗传分化分析表明，核心区和非核心区水稻纹枯病菌各居群间有一定的基因交流，群体间的遗传变异相对较小，但相比而言，核心区群体间有较多的基因交流，而非核心区群体间的基因交流相对较少，其群体间的遗传变异程度相对更明显，因为水稻纹枯病菌主要以菌核的形式进行传播，而非核心区的地形较核心区要复杂很多，对菌核的传播具有一定的限制作用。同时也说明了非核心区水稻纹枯病菌群体的地理分布对其遗传分化产生了一定的影响。Wang等[7]对我国南方 6 个地区的 180 株水稻纹枯病菌进行了 RAPD 分析，也发现这些菌株间具有丰富的遗传多样性，各群体的菌株间存在较高水平的基因漂流现象，致使这些变异大部分发生在种群内。本实验室之前曾采用 ISSR 技术对我国华南地区的 72 株水稻纹枯病菌进行了遗传多样性和遗传结构分析，同样发现这些菌株间存在高水平的遗传差异，各群体菌株间存在明显的基因交流现象，并且大部分变异出现在种群内[9]。本研究结果与之前的研究结果较相似。

南繁核心区和非核心区水稻纹枯病菌群体的遗传一致性和遗传距离分析表明，非核心区屯昌县水稻纹枯病菌群体的亲缘关系与核心区各群体较接近，作者推测可能是因为在该县所采集的水稻纹枯病菌均来自海南省屯昌县农业科学研究所基地，而这个基地的水稻品种丰富且多来自全国各地，与核心区较频繁的水稻品种交流较相似，故遗传差异较接近。

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Genetic Diversity and Pathogenicity Differentiation ofAG-1 IA from South China Crop Breeding Area in Hainan Province

ZHU Minghai, PENG Dandan, SHU Canwei, ZHOU Erxun*

(/,,,;Corresponding author,:)

【Objective】In order to clarify the genetic differentiation and the correlation between genetic diversity and pathogenicity ofAG-1 ⅠA in South China Crop Breeding Area, the genetic diversity, population genetic structure, pathogenicity and the correlation between genetic diversity and pathogenicity of 60AG-1 IA isolates collected from the core region (Sanya, Ledong and Lingshui) and non-core region (Qiongzhong, Tunchang and Ding’an) of South China Crop Breeding Area were comparatively analyzed 【Method】by using AFLP molecular marker technique and detached leaf inoculation method. 【Result】The cluster analysis results showed that the genetic diversity ofAG-1 ⅠA in the core region was relatively higher. The analysis results of population genetic structure showed that the percentage of polymorphic loci (PPL), Nei’s gene diversity index (), Shannon’s information index () and gene flow (m)in the core population were 82.24%, 0.1932, 0.3062 and 2.5627, respectively, higher than those of non-core population with PPL,andmbeing 67.49%, 0.1535, 0.2447 and 0.9365, respectively. However, the genetic differentiation coefficient (st) in the core population was 0.1633, lower than that of non-core population whosestwas 0.3481. 【Conclusion】These results showed that the degree of genetic variation of the isolates from core region was higher than that of the isolates from non-core region. Much gene flow among the core populations and little gene flow among the non-core populations existed, but the genetic variation of both regions was mainly within the population. Overall, the degree of genetic differentiation in the isolates of core region was higher. The results of pathogenicity and correlation between genetic diversity and pathogenicity showed that most isolates from core region belonged to the medium pathotypes and most isolates from non-core region belonged to the medium or strong pathotypes, but there was no correlation between pathogenicity and AFLP lineage.

South China Crop Breeding Area;AG-1 ⅠA; genetic diversity; population genetic structure; pathogenicity differentiation; AFLP

10.16819/j.1001-7216.2019.8048

S435.111.4+2

A

1001-7216(2019)02-0176-10

2018-04-17；

2018-05-30。

国家公益性行业（农业）科研专项(201403075)。