基于Wnt信号通路研究骨康方对过表达DKK1大鼠骨形成影响

卢义 张文财 万雷 黄宏兴

1. 广州中医药大学，广东 广州 510405 2. 广州中医药大学附属骨伤科医院骨科，广东 广州 510240

骨质疏松症(osteoporosis，OP) 是常见的骨代谢性疾病，主要特点为单位体积内骨量减少，皮质骨变薄，海绵骨骨小梁数目及大小均减少，骨髓腔增宽，骨骼载荷能力减弱。随着年龄的增加，发生骨折的风险也相应增加。到2017年末，我国60岁以上的人口为2.4亿，占总人口17%。老龄人口还在以每年800万人的速度增加，预计至2050年，老龄人口将达到总人口的1/3[1]。Wnt信号通路是与骨代谢关系密切的一个重要信号通路，它与骨质疏松症密切相关。Dickkopf相关蛋白1(dickkopf related protein 1，DKK1)是Wnt信号通路的抑制因子，在骨形成过程中起重要作用，被视为骨质疏松、骨修复的治疗靶点[2]。本课题组在前期研究了骨康方干预过表达DKK1骨细胞的影响，结果显示骨康方含药血清可以提高细胞活性,提高BMP2的相对表达量，有利于成骨细胞的矿化，尤其在过表达DKK1干预后[3]。但骨康方对过表达DKK1生物体的效果如何还未见报道，本研究将从Wnt信号通路的方向，研究其对过表达DKK1大鼠骨形成的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物

选取3月龄SPF级雌性SD大鼠18只，体重(245±25)g，均购于广州中医药大学动物实验中心(合格证：SCXK(粤)2013-0034)。饲养于室温24～28 ℃, 相对湿度为55%～65%,自由摄食水，每天照明12 h, 黑暗12 h。对动物的整个处置过程符合科技部《关于善待动物的指导性意见》要求。骨康方(熟地黄10 g、淫阳藿 10 g、大枣10 g、肉苁蓉10 g、丹参 10 g、当归10 g、补骨脂 10 g、菟丝子 10 g、白芍 10 g、黄芪 10 g)由广州中医药大学附属骨伤科医院提供并制成水煮液(1.43 g /mL生药)。

1.2 仪器和试剂

Trizol (Thermo公司)，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(Takara 公司)，Mini BEST Universal RNA Extraction Kit(Takara 公司)，Microseal B seal、Hard-Shell PCR Plate3 96-Well(Takara 公司)，Primescript RT Master Mix(Takara 公司)，异丙醇(广州化学试剂厂)，氯仿(广州化学试剂厂)，超净操作台(苏州安泰空气技术有限公司)，水合氯醛(广州化学试剂厂)，TC-3 K 电子天平(深圳市华恒科技有限公司)，隔离独立空气换气系统IVC(冯氏实验动物设备有限公司)，扫描仪[MICROTEK (Bio-5000)]，高速冷冻离心机(Sigma)，PCR仪(Bio-Rad)，漩涡混合器(海门市其林贝尔仪器)，CFx96 TouchTM Real Time PCR Detection(Bio-Rad)，T100 Themal Cycler(Bio-Rad)，NanoDrop ND-2 000分光光度计(NanoDron Technologies)，Hologic discovery A骨密度仪(Hologic,美国)。

1.3 实验方法

1.3.1大鼠分组及腺病毒转染：将大鼠随机分为A 空白对照组(NC)，B 空载腺病毒组(Ad-EV)，C 过表达DKK1腺病毒感染组(Ad-DKK1)，每组6只,用苦味酸标为1～6号；分别用空载腺病毒(Ad-EV)和重组腺病毒(Ad-DKK1)感染B组、C组，腺病毒构建方法参考前期研究基础[4]。病毒液解冻后，吸取1 260 μL的0.9%无菌生理盐水至各组滴度为1011包装好的病毒液中，使之成为滴度为1010的病毒液；用一次性1 mL注射器吸取200 μL病毒液，通过腹腔注射转染大鼠。过表达DKK1腺病毒转染组腹腔注射过表达DKK1腺病毒，空载腺病毒组腹腔注射空载腺病毒，空白对照组注射相同体积的生理盐水。1周后对大鼠进行眼眶采血，PCR验证腺病毒转染成功。腺病毒转染1个月后[5]开始中药干预，灌胃给药容积为10 mL/kg，每组1～3号按4.8 g/kg灌胃中药[6]，4～6号灌等体积生理盐水，所用药物以蒸馏水定容至所需浓度，每天灌胃2次，间隔5 h，连续灌胃2个月。

1.3.2取材及测定骨密度：中药灌胃2个月后，水合氯醛麻醉，颈椎脱臼处死。取大鼠股骨，左侧股骨浸入4%多聚甲醛液中固定，右侧股骨放置无菌冻存管，液氮冻存备用。将浸在甲醛中的股骨用Hologic discovery A骨密度仪及仪器自带动物软件测定骨密度，使用软件中“局部放大”功能测定股骨骨密度，误差系数(CV值)：1%。液氮中的股骨提取RNA后PCR验证。

1.3.3RT-PCR 检测：参照美国国立生物技术信息中心(NCBI)公布的cDNA设计上下游引物，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。总RNA提取：液氮中取出股骨，取松质骨50 mg，液氮研磨至粉状，TRIZOL法提取总RNA，反转录合成cDNA。PCR 反应液的配制：SYBR© Premix Ex Taq II(TliRNaseH Plus)7.5 μL，PCR Forward Primer(10 μmol/L)0.5 μL，PCR Reverse Primer(10 μmol/L)0.5 μL，cDNA 2.0 μL，dH2O 4.5 μL，PCR反应：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s,60 ℃退火30 s，40 个循环。采用 2-△△Ct法统计分析。△Ct=Ct目的基因-Ct内参基因， △△Ct=△Ct待测样品中目的基因-△Ct对照样品中目的基因，相对样品模板量=2-△△Ct。引物序列见表1。

图1 骨康方对DKK1、ACTIN表达影响Fig.1 Effect of Gukang recipe on DKK1 and ACTIN

表 1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.4 统计学处理

实验数据采用SPSS 20.0软件进行统计分析，结果以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验，组间比较采用单因素方差分析，以P<0. 05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 转染后大鼠血液中DKK1表达量

结果显示，Ad-DKK1组DKK1表达量明显高于NC组(P<0.05)和Ad-EV组(P<0.05)，腺病毒转染成功，见表2。

表 2 大鼠血液DKK1表达量Table 2 DKK1 expression in rat blood

注:与NC组比较，#P<0.05; 与Ad-EV组比较，*P<0.05。

2.2 各组大鼠股骨BMD变化

结果显示，过表达DKK1组(Ad-DKK1)股骨BMD均低于NC组、Ad-EV组(P<0.05)；在NC组、Ad-EV组、Ad-DKK1组内，骨康方灌胃大鼠BMD均高于生理盐水灌胃(NS)大鼠(P<0.05)；空白对照组(NC)和空载腺病毒组(Ad-EV)无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表 3 大鼠BMD分析(g/cm2)Table 3 Analysis of BMD in each group (g/cm2)

注:与NC组比较，#P<0.05; 与 Ad-DKK1组灌胃NS比较，*P<0.05。

2.3 骨康方对大鼠Wnt通路相关因子的影响

结果显示在各组内，骨康方灌胃大鼠APC mRNA 相对表达量均低于生理盐水灌胃(NS)大鼠(P<0.05)；在组间，Ad-DKK1组APC mRNA 相对表达量均高于NC组、Ad-EV组(P<0.05)。见表4～表8。

表 4 APC mRNA 相对表达量Table 4 Relative expression APC mRNA

注:与NC组比较，#P<0.05; 与 Ad-DKK1组灌胃NS比较，*P<0.05。

图2 骨康方对APC mRNA表达影响Fig.2 Effect of Gukang recipe on APC mRNA

图3 骨康方对LRP6表达影响Fig.3 Effect of Gukang recipe on LRP6

由表5可见，在各组内，灌胃骨康方大鼠LRP6 mRNA相对表达量均高于灌胃生理盐水(NS)大鼠(P<0.05)；在组间，Ad-DKK1组LRP6 mRNA相对表达量均低于NC组、Ad-EV组(P<0.05)。

由表6可见，在各组内，骨康方灌胃大鼠β-catenin mRNA相对表达量均高于生理盐水灌胃(NS)大鼠(P<0.05)；在组间，Ad-DKK1组β-catenin mRNA相对表达量均低于NC组、Ad-EV组(P<0.05)。

表 5 LRP6 mRNA 相对表达量Table 5 Relative expression LRP6 mRNA

注:与NC组比较，#P<0.05; 与 Ad-DKK1组灌胃NS比较，*P<0.05。

表 6 β-catenin mRNA 相对表达量Table 6 Relative expression β-catenin mRNA

注:与NC组比较，#P<0.05; 与 Ad-DKK1组灌胃NS比较，*P<0.05。

由表7可见，在各组内，骨康方灌胃大鼠RUNX2 mRNA相对表达量均高于生理盐水灌胃(NS)大鼠(P<0.05)；在组间，Ad-DKK1组RUNX2 mRNA相对表达量均低于NC组、Ad-EV组(P<0.05)。

图4 骨康方对β-catenin表达影响Fig.4 Effect of Gukang recipe on β-catenin

表 7 RUNX2 mRNA 相对表达量Table 7 Relative expression RUNX2 mRNA

注:与NC组比较，#P<0.05; 与 Ad-DKK1组灌胃NS比较，*P<0.05。

由表8可见，在各组内，骨康方灌胃大鼠OPG mRNA相对表达量均高于生理盐水灌胃(NS)大鼠(P<0.05)；在组间，Ad-DKK1组OPG mRNA相对表达量均低于NC组、Ad-EV组(P<0.05)。

图5 骨康方对RUNX2表达影响Fig.5 Effect of Gukang recipe on RUNX2

表8 OPG mRNA 相对表达量Table 8 Relative expression OPG mRNA

注:与NC组比较，#P<0.05; 与 Ad-DKK1组灌胃NS比较，*P<0.05。

图6 骨康方对OPG表达影响Fig.6 Effect of Gukang recipe on OPG

2.4 骨康方对DKK1、OPG蛋白的影响

由Western blot结果可见：①过表达DKK1抑制OPG表达；②与灌胃生理盐水比较，灌胃骨康抑制DKK1蛋白表达，促进OPG蛋白表达。

图7 骨康方对DKK1、OPG蛋白的影响注：NC:空白对照组。Ad-EV：空载腺病毒组。Ad-DKK1:过表达DKK1组。GK:骨康。NS：生理盐水。Fig.7 Effect of Gukang recipe on DKK1 and OPG protein

3 讨论

中医对骨质疏松症有着独到的见解，骨质疏松在中医属“骨痿”。中医认为骨痿与肾、脾、肝、血瘀密切相关。骨康方以补骨脂为君药，熟地、淫羊藿、白芍为臣药，共奏补肾壮骨、滋阴益精之效。有学者[7]认为肾精与骨髓间充质干细胞在来源、功能上有许多相似性, 骨髓间充质干细胞及其功能是肾精在细胞水平上的表现形式，肾精亏虚导致的骨质疏松症必定影响到骨髓间充质干细胞及其功能，而补肾中药具有干预骨髓间充质干细胞的作用。现代医学[8]已经证实补肾中药可以通过调节Wnt/β-catenin信号通路促进成骨细胞增殖分化。曹大林等[9]研究后认为，补骨脂能够明显提高骨密度，上调β-catenin蛋白表达,激活Wnt信号通路。脾主四肢，为后天之本，气血生化之源，脾虚是骨质疏松症发生的重要因素。正如朱丹溪[10]所述：“大抵脾胃虚弱，阳气不能生长……则骨乏无力，令人骨髓空虚，足不能履地”。所以治骨痿，健脾是关键，骨康方配以黄芪补脾益气。欧莉等[11]研究后认为，熟地配伍黄芪能激活Wnt/LRP/β-catenin信号通路，降低破骨细胞活性，促进成骨细胞生成,达到调节骨代谢的目的。人体的气和血周流于全身，是脏腑经络包括骨骼等一切组织器官进行生理活动的物质基础。《灵枢·本脏》中描述道：“气滞不行，营运无力……筋骨失养。”骨康方以当归、丹参活血通络，达到补中寓通、补而不滞的目的。杨亚军[12]认为，丹参素能直接上调经典Wnt/β-catenin/Tcf信号通路，或者通过抑制FoxO3a信号通路间接促进Wnt通路的激活，从而调控成骨分化功能,发挥抗骨质疏松作用。

骨康方对治疗脾肾阳虚型、肝肾阴虚型、气滞血瘀型骨痿有很好的疗效[13-14]，但是其具体的作用机制还有待进一步研究。王凡[15]的研究表明，骨康方含药血清可以提高细胞活性，降低钙离子浓度，抑制细胞的凋亡，有利于成骨细胞矿化，尤其在过表达DKK-1干预后。本课题组前期在细胞水平方面研究了骨康方对过表达DKK1骨细胞的影响，本研究基于Wnt信号通路研究骨康方在过表达DKK1生物体内的影响。结果显示过表达DKK1会抑制Wnt信号通路，Wnt信号通路受体LRP6 mRNA表达量降低，细胞内APC含量升高，与Axin、GSK-3β和β-catenin形成复合体，降解β-catenin，使得下游RUNX2和OPG mRNA表达量降低。给予骨康方干预的大鼠较无骨康方干预大鼠骨密度升高，Wnt信号通路抑制因子DKK1、APC表达量降低，Wnt信号通路中LRP6、β-catenin、RUNX2和OPG表达量升高。Wnt/β-catenin信号通路是一条经典信号通路，它具有调控骨的代谢包括成骨细胞的增殖和分化等功能，激活Wnt/β-catenin信号通路可以促进成骨细胞增殖分化[16]。有实验[17-18]证明，在骨髓间充质干细胞中，Wnt信号在骨质疏松症期间持续受到抑制。DKK家族是一组分泌型糖蛋白，共有4种：DKK1、DKK2、DKK3 和DKK4[19]。DKK1基因在骨疾病、肿瘤及肾脏、肝脏中发挥重要作用，同时也是Wnt/β-catenin 信号通路抑制剂，通过与脂蛋白相关蛋白受体6(LRP6)形成复合物，使LRP内化和降解，以此降低LRP和Wnt配体的结合率[20-21]。DKK1与LRP6的结合使细胞内糖原合成激酶-3β(GSK-3β)、腺瘤息肉蛋白(APC)、轴抑制蛋白(Axin)含量升高，并形成降解复合体，降解β-catenin[22]。研究[23]表明，当β-catenin在胞质中达到稳定水平时，便可进入核内，与T细胞因子/淋巴增强因子(t cell factor/lymphoid enhancing factor，TCF/LEF)结合,调节Runx2等骨靶基因的表达，进而促进成骨细胞分化。没有β-catenin向细胞核内转移积累，β-catenin就无法通过与 TCF/LEF 结合，从而促进下游RUNX2、OPG等靶基因的表达[24]。Runx2(runt-related transcription factor 2) 是促进骨形成的关键调控因子，通过调控成骨细胞特异性细胞外基质蛋白基因的表达和成骨细胞周期参与成骨细胞的分化过程，促进骨形成和抑制骨吸收[25]。骨保护素(OPG)是调节骨重建过程中破骨细胞功能的重要调节因子，OPG可以抑制破骨细胞功能,减少骨质破坏[26]。

综上，过表达DKK1可导致大鼠股骨骨密度降低，骨康方可以通过促进Wnt信号通路中LRP6、β-catenin、RUNX2、OPG基因的表达促进成骨，抑制Wnt信号通路抑制因子DKK1的表达，为骨康方治疗骨质疏松症提供了新的动物实验依据，但其起主要作用的成分以及治疗骨质疏松的其他机制还有待进一步研究。