地塞米松通过线粒体途径诱导成骨细胞凋亡的研究

伍龙果 蔡劲薇 潘吉铭 梁敏

广西医科大学第一附属医院内分泌科， 广西 南宁 530021

地塞米松(dexamethasone, DEX)等糖皮质激素(glucocorticoid, GC)在临床上应用广泛，长期或大剂量使用糖皮质激素可引起骨量丢失，导致糖皮质激素性骨质疏松症(glucocorticoid-induced osteoporosis, GIOP)，增加骨折发生风险，导致患者致死致残，严重影响患者的生活质量[1]。GIOP的发病机制复杂，目前尚未完全阐明。有研究认为，成骨细胞凋亡是GIOP重要的发病机制之一[2]。已知细胞凋亡信号通路有三条，分别是线粒体通路、内质网通路和死亡受体通路，其中线粒体凋亡通路是凋亡的主要途径[3]。目前，尚无地塞米松对成骨细胞线粒体的超微结构改变的相关报道。本研究采用不同浓度的地塞米松干预体外培养SD大鼠的成骨细胞，检测成骨细胞的凋亡率，观察线粒体超微结构和线粒体膜电位的改变，探讨地塞米松对成骨细胞凋亡的分子作用机制，为临床防治GIOP提供依据。

1 材料和方法

1.1实验动物：SD大鼠(出生<24 h)，不分雌雄，由广西医科大学动物中心提供。

1.2实验材料与仪器

1.2.1试剂：胎牛血清(Lonsera)，低糖DMEM培养基、I型胶原酶 (Gibco)；地塞米松(Selleck)；碱性磷酸酶BCIP/NBT染色试剂盒、JC-1试剂盒(碧云天)；胰蛋白酶、茜素红S染色液、TritonX-100、DAPI溶液(索莱宝)；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(BD公司)。

1.2.2仪器：超净工作台(苏州净化公司)，CO2培养箱(Scientific公司)，荧光倒置相差显微镜(Olympus公司)，流式细胞仪(BD公司)，荧光酶标仪(Scientific公司)，电镜(HTACHI公司)。

1.3实验方法

1.3.1细胞培养：无菌条件下取出SD乳鼠的颅骨，放入PBS液中，清洗血迹、剔除附着的结蹄组织。PBS液清洗3次，将清洗干净的骨片转移至3 mL 0.25%的胰蛋白酶溶液中，于37 ℃培养箱中消化10 min，用含胎牛血清的培养液终止消化，弃上清；骨片转移至5 mL 0.2%的Ⅰ型胶原酶并完全剪碎约1 mm×1 mm×1 mm大小，置于37 ℃培养箱中消化2 h，1 000 r/min 离心5 min，弃上清；用含10%的胎牛血清、100 mg/L链霉素、100 U/mL青霉素的DMEM培养液重悬沉淀物，接种于0.25 cm2的培养瓶中，置于体积分数5% CO2、37 ℃恒温培养箱中培养，36 h后换液，以后每2天换液一次，连续消化法纯化。待细胞密度>90%时，0.25%胰蛋白酶消化、传代。

1.3.2成骨细胞鉴定：碱性磷酸酶染色鉴定：取对数增长期成骨细胞，按细胞密度1×105/mL接种至无菌细胞培养皿中，48 h后弃培养皿中培养液，PBS液洗两次，95%乙醇固定15 min，按照碱性磷酸酶BCIP/NBT染色试剂盒说明书进行成骨细胞染色鉴定。

茜素红钙结节染色鉴定：连续培养细胞21 d后，弃培养液，用PBS液洗2次，95%乙醇固定15 min，用PBS液洗3次，0.2%茜素红染色45 min，PBS液冲洗3次，于倒置显微镜下拍照观察。

1.3.3DAPI染色观察成骨细胞核的形态变化：取第2代对数生长期成骨细胞，消化重悬，按4×104/mL接种于细胞爬片6孔板中，待细胞长至80%时进行干预，24 h后用镊子夹出细胞爬片，PBS液洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，弃固定剂，PBS液洗3次，每次10 min。加入15μg/mL 4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)溶液常温避光孵育10 min，荧光显微镜下观察细胞核的形态学变化。

1.3.4透射电镜观察成骨细胞及其线粒体变化：取第2代对数生长期的成骨细胞接种至培养瓶，待细胞密度达90%进行干预，24 h后弃培养液，PBS洗2次，用含有0.25%胰酶消化并收集细胞至15 mL离心管中，1 000 r/min 离心5 min；加入1 mL PBS并转移至1.5 mL EP管中，1 200 r/min，离心5 min，清洗3次；弃上清，向沉淀中加入4%戊二醛，于4 ℃过夜，对样本进行一系列处理后，用透射电镜观察细胞切片并拍照。

1.3.5Annexin V-FITC/PI 流式细胞术测定成骨细胞凋亡率：将干预24 h后的细胞消化、离心、收集、漂洗，加入Binding Buffer 150 μL重悬细胞。加入Annexin V-FITC 5 μL充分混匀后再加入PI染色液10 μL，室内温度下避光反应10 min。最后，向各组细胞中加入 Binding Buffer定容至500 μL，立即用流式细胞仪检测。

1.3.6线粒体膜电位检测：取第4代的成骨细胞，按4×104/mL密度接种于96孔板中，待其密度>90%，加入药物进行干预24 h，弃培养液，加入JC-1工作液(300 nmol/L JC-1)，于37 ℃孵育20 min，JC-1缓冲液洗涤2次后，加入细胞培养液。荧光酶标仪检测线粒体膜电位。设置激发光为490 nm、发射光为530 nm检测JC-1单体；设置激发光为525 nm、发射光设为590 nm检测JC-1聚合物。

1.4统计学处理

2 结果

2.1SD大鼠体外培养成骨细胞的鉴定

图1 成骨细胞形态及染色A：成骨细胞形态×40 B:碱性磷酸酶染色×100 C:茜素红染色 ×100。Fig.1 Morphology and staining of osteoblast

纯化后的成骨细胞贴壁生长48 h后，细胞呈梭行、三角形等不规则形，可见胞质、胞核(图1 A)。碱性磷酸酶染色后，成骨细胞胞浆中有许多染成紫黑色颗粒或块状沉淀(图1B)。成骨细胞连续培养21 d后，细胞会重叠生长，形成不透明的钙化结节，结节经茜素红染色呈橙红色(图1C)。2.2地塞米松对成骨细胞核影响

采用10-8、10-6、10-4mol/L地塞米松干预成骨细胞24 h，DAPI染色后，用荧光显微镜观察，发现空白对照组成骨细胞界限清晰，胞质完整，胞浆丰富；10-8mol/L地塞米松组成骨细胞界限较清晰，无明显细胞核缩小、核裂解，很少发生凋亡；10-6mol/L和10-4mol/L地塞米松组成骨细胞发生明显凋亡，细胞核缩小，可见核解体等凋亡现象；与10-6mol/L地塞米松组相比，10-4mol/L组成骨细胞凋亡现象明显增多。提示随着地塞米松的浓度增加，成骨细胞凋亡现象增加。见图2。

图2 地塞米松对成骨细胞凋亡的影响(×40)A：空白对照组；B：DEX 10-8mol/L；C：DEX 10-6mol/L；D：DEX 10-4mol/L白色箭头所指为凋亡细胞核。Fig.2 Effect of dexamethasone on apoptosis of osteoblasts (×40)

2.3地塞米松对成骨细胞线粒体的影响

采用透射电镜观察，发现空白对照组成骨细胞中细胞核形状规整，胞质内线粒体丰富，线粒体结构完整，线粒体嵴清晰完整；10-8mol/L地塞米松组成骨细胞的细胞核形状较规整，胞质内线粒体数目较多，线粒体结构较完整，线粒体嵴较清晰，与空白对照组相比，细胞核及线粒体结构变化不明显；10-6mol/L地塞米松组成骨细胞的细胞核出现核固缩，核染色质致密浓染，凝集于核膜周边，出现染色质边集，胞质内线粒体数目较空白对照组的明显减少，线粒体肿胀，仍可见线粒体嵴；10-4mol/L地塞米松组成骨细胞的细胞胞核固缩明显、染色质凝集成块，线粒体大小不一，肿胀明显，出现大量空泡样改变，线粒体嵴断裂(图3)。

图3 透射电镜下观察地塞米松诱导成骨细胞凋亡的影响A：空白对照组；B：DEX 10-8mol/L；C：DEX 10-6mol/L； D：DEX 10-4mol/L；A1、B1、C1、D1 标尺2 μm，A2、B2、C2、D2标尺1 μm；白色箭头所指为线粒体。Fig.3 Effect of dexamethasone on osteoblasts apoptosis with transmission electron microscope

2.4地塞米松对成骨细胞凋亡的影响

采用不同浓度的地塞米松干预成骨细胞24 h，结果发现，10-8、10-6、10-4mol/L组成骨细胞凋亡率分别为(2.070±0.644)%、(8.340±0.835)%、(32.273±0.870)%，与空白对照组相比较，10-8mol/L组成骨细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)；10-6mol/L和10-4mol/L地塞米松组成骨细胞凋亡率明显升高，10-6mol/L和10-4mol/L地塞米松组的成骨细胞凋亡率分别较空白对照组增加7.240% 和31.173%(P<0.05)，差异有统计学意义(P均<0.05)。随着地塞米松浓度的增加，成骨细胞的凋亡率也逐渐升高，提示地塞米松可诱导成骨细胞凋亡，呈剂量依赖性(表1)。

表1 地塞米松对成骨细胞凋亡的影响Table 1 Effect of dexamethasone on osteoblast apoptosis

注：与空白对照组相比，aP< 0.05；与10-8mol/L地塞米松组相比，bP<0.05；与10-6mol/L地塞米松组相比，cP<0.05。

2.5地塞米松对成骨细胞线粒体跨膜电位的影响

采用不同浓度地塞米松干预成骨细胞，结果发现10-8、10-6、10-4mol/L组F值(即发生线粒体膜电位下降的细胞比例)分别为(45.760±2.811)%、(52.533±3.058)%、(63.565±3.107)%，与空白对照组相比较(45.719±4.076)%，10-8mol/L组成骨细胞线粒体跨膜电位无明显下降，差异无统计学意义(P>0.05)，10-6mol/L和10-4mol/L地塞米松组成骨细胞线粒体跨膜电位明显减低，10-6mol/L和10-4mol/L地塞米松组膜电位分别较空白对照组降低6.814% 和17.846%(P<0.05)，差异有统计学意义(P均<0.05)。随着地塞米松浓度的增加，成骨细胞线粒体跨膜电位逐渐下降，提示地塞米松可诱导线粒体电位减低，呈剂量依赖性(表2)。

表2 地塞米松对成骨细胞线粒体膜电位的变化

注：空白对照组相比，aP< 0.05；与10-8mol/L地塞米松组相比，bP<0.05；与10-6mol/L地塞米松组相比，cP<0.05。

3 讨论

GC在临床上应用广泛，在抗炎、抗休克、抑制免疫等方面发挥着重要的作用[4]。国外一项约四万人的流行病学调查研究发现，约1%～2%的患者长期接受糖皮质激素治疗[5]。长期服用地塞米松等糖皮质激素，可致内源性及外源性GC过多，引起骨质流失和GIOP等不良反应[6]。引起这些不良反应是由于地塞米松可抑制骨形成，骨形成与成骨细胞的数量及变化密切相关[7]。我们前期的研究也发现，长期、大剂量的地塞米松可明显抑制骨形成，导致SD大鼠发生骨质疏松[8]。临床研究发现，长期使用GC治疗可引起骨组织中成骨细胞凋亡率增加、成骨细胞数量减少。细胞实验研究证实，大剂量地塞米松可诱导成骨细胞凋亡[9-10]，但具体的凋亡机制目前仍不明确。

常用检测细胞凋亡的方法有：①显微镜观察；②荧光标记膜蛋白；③流式细胞术；④ TUNEL等[11]。透射电镜可以观察到细胞在凋亡不同时期超微结构的变化，比生化指标更敏感，被认为是研究细胞凋亡的经典方法[12]。本研究通过采用透射电镜观察成骨细胞及其线粒体超微结构、检测成骨细胞线粒体跨膜电位的变化，探讨地塞米松诱导成骨细胞凋亡可能的机制。

DAPI是一种可与细胞核中的双链DNA结合的荧光染料[13]。对细胞核进行DAPI染色后，用荧光显微镜观察细胞核的变化以判断细胞凋亡的进程。本研究采用10-8、10-6、10-4mol/L的地塞米松干预成骨细胞，DAPI染色结果显示，10-6mol/L和10-4mol/L的地塞米松作用于成骨细胞24 h后，成骨细胞出现核解体、核固缩等典型的凋亡特征；而10-8mol/L地塞米松组成骨细胞凋亡不明显。我们进一步采用流式细胞术检测成骨细胞凋亡，结果发现，随着地塞米松浓度的增大，成骨细胞的凋亡率也随之增高，10-8、10-6、10-4mol/L地塞米松组成骨细胞凋亡率分别较空白对照组增加0.970%、7.240% 和31.173%，呈剂量依赖性。Liu等[14]的研究也发现随着地塞米松浓度的增高，成骨细胞的凋亡率逐渐增加。采用透射电镜观察成骨细胞的超微结构，结果发现，随着地塞米松浓度的增加，细胞核固缩、染色质边集现象明显，这提示地塞米松可诱导细胞凋亡；同时随着地塞米松浓度的增加，成骨细胞的线粒体肿胀、空泡样变化增多，提示地塞米松诱导成骨细胞凋亡可能与线粒体结构改变有关。

线粒体是细胞凋亡过程中的核心细胞器，线粒体跨膜电位变化与细胞凋亡关系密切[15]。在细胞凋亡过程中，线粒体内膜的通透性变化引起线粒体跨膜电位改变[16]。当各种凋亡信号刺激线粒体，导致线粒体膜电位下降甚至消失，从而启动细胞凋亡程序[17]。国内有研究发现，随着地塞米松浓度的增加，MC3T3-E1成骨样细胞的线粒体膜电位逐渐下降[18]。本研究也发现，随着地塞米松浓度的增加，线粒体跨膜电位明显下降，10-8、10-6、10-4mol/L地塞米松组成骨细胞线粒体跨膜电位分别较空白对照组下降0.04%、6.81%、17.85%，提示地塞米松可引起成骨细胞线粒体膜电位下降，呈剂量依赖性，从而诱导了成骨细胞凋亡。

综上所述，10-6mol/L和10-4mol/L地塞米松可诱导SD大鼠体外分离培养的成骨细胞发生凋亡，其机制可能与线粒体有关。