Cyp4a14基因缺失对葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠肠炎的影响

肖中岳，轩青霞，高 强

1)河南科技大学第一附属医院肿瘤科 河南洛阳 471003 2)洛阳市妇女儿童医疗保健中心超声科 河南洛阳 471023

炎症性肠病是由多种因素引起的慢性复发性非特异性的炎症疾病[1]。目前的研究[2-3]显示，该病的发生是由于多种致病因素破坏了肠道内环境的稳态，使得肠道黏膜的免疫功能发生失调，进而损伤肠道的黏膜屏障，最终导致炎症性肠病的发生。不同类型的肠道黏膜上皮细胞的协同作用是肠道黏膜屏障形成的基础，其中杯状细胞是肠道上皮中的黏液分泌细胞，其分泌的黏液可以有效地保护肠道黏膜，减少肠道黏膜损伤[4-6]。近期研究[7]发现，杯状细胞减少与人克罗恩病活动期和溃疡性结肠炎有关。Cyp4a14蛋白是一种肝脏细胞色素P450 ω-羟化酶，在人体中其主要作用是参与中长链脂肪酸和前列腺素的氧化代谢[8]。有研究[9]显示，Cyp4a14蛋白可以破坏体内氧化-抗氧化系统平衡，导致大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)和脂质过氧化物产生，进而促进机体的炎症反应。本研究通过建立Cyp4a14基因敲除小鼠肠炎模型，探讨Cyp4a14基因在肠炎发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 实验动物 健康清洁级129S1/SvJ种系Cyp4a14野生型(wild type,WT；Cyp4a14+/+)和基因敲除纯合型(knockout,KO；Cyp4a14-/-)小鼠(由深圳大学提供)，饲养于河南科技大学第一附属医院动物实验中心，维持室内温度20～22 ℃，湿度保持在50%左右，室内灯光明暗交替的周期是12 h，给予小鼠足量SPF级混合配方颗粒饲料(购于北京华阜康生物公司)，自由饮水，每日更换新鲜饮水，保持小鼠生活环境清洁卫生及通风良好。

1.1.2 主要试剂 葡聚糖硫酸钠(DSS，相对分子质量为36 000～50 000)购于美国MP Biomedicals公司。快速DNA提取扩增试剂盒购于北京康为世纪生物科技有限公司，PAS染色试剂盒购于美国Sigma公司。总RNA提取试剂Trizol购于美国Invitrogen公司，反转录和qRT-PCR试剂盒购于日本TaKaRa公司，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成(表1)。

1.2入组准备由于Cyp4a14基因的表达与性别有关[10]，实验过程中所用小鼠均为雄性。选用WT和KO同窝小鼠作为种鼠，繁殖出的后代可出现WT(Cyp4a14+/+)、杂合子(Cyp4a14+/-)和KO(Cyp4a14-/-)3种表型。剪取小鼠尾巴末端约0.5 cm，按快速DNA提取扩增试剂盒说明书操作抽提DNA，随后PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠基因。引物序列：Cyp4a14+/+，5’-TCAGGGTT GAAAAAGAATGAC-3’；Cyp4a14-/-，5’-GCCAGAG GCCACTTGTGTAG-3’；Cyp4a14+/-，5’-TGC CCATTTTTCACACAAAA-3’。Cyp4a14+/+目的片段长299 bp，Cyp4a14-/-目的片段长199 bp，Cyp4a14+/-目的片段长299和199 bp，根据条带判断每只小鼠的基因型(图1)。

表1 引物序列

M：Marker；1：Cyp4a14+/+; 2：Cyp4a14+/-; 3：Cyp4a14-/-

1.3小鼠分组与肠炎模型建造选择6～8周龄、体重为18～25 g小鼠，通过基因鉴定分为WT组和KO组，各20只，再将WT组和KO组小鼠随机分成WT对照组、WT DSS组和KO对照组、KO DSS组，每组10只。先将小鼠适应性喂养1周，然后对照组给予高压灭菌饮用水，DSS组给予含30 g/L DSS高压灭菌饮用水，自由饮用6 d。各组小鼠给予足量饲料，不再另予饮水。每日定时测量小鼠体重，观察并记录小鼠的摄食饮水量、大便性状以及活动情况等，参照Jackson等[11]的方法进行疾病活动指数(DAI)评分。

1.4取材及血便评分造模结束后处死所有小鼠，剖腹取出全结肠，测量结肠长度并肉眼观察结肠内容物情况。按照张静等[12]的方法进行血便评分：0分，无出血；1分，结肠1/3出血；2分，结肠2/3出血；3分，整个结肠内均有出血。用预冷的PBS漂洗后，自远端结肠始取约0.5 cm，用甲醛溶液固定，石蜡包埋，4 μm厚度切片，用于HE染色、PAS染色及免疫组化染色；再取1.0 cm放入RNA Later液中，-80 ℃保存，用于提取RNA。

1.5结肠组织病理学观察及评分对结肠组织进行HE染色后，400倍显微镜下行细胞计数，每张切片选择10个视野，然后在每个视野中观察100个细胞。参照文献[13]的评分标准对切片进行组织学评分。中性粒细胞和淋巴细胞浸润：0～3分；潘氏细胞和杯状细胞脱颗粒：0～2分；上皮细胞反应，如隐窝缺失：0～3分；炎症病灶：0～3分。各项评分相加得出组织病理学评分，急性炎症的临界值为6～7分。

1.6结肠和肝脏组织中Cyp4a14以及炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA表达的检测总RNA提取采用Trizol法，测定纯度和浓度后取RNA 2 μg，使用TaKaRa试剂盒将总RNA反转录为cDNA，-30 ℃冻存备用。冰上制备PCR反应体系，以β-actin作为内参，以Ct值表示结果，每个样本3个复孔，PCR反应程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，59 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，40个循环。采用2-ΔΔCt法计算各指标mRNA的相对表达量。

1.7结肠组织中杯状细胞计数采用PAS染色法对结肠组织中杯状细胞进行染色。在400倍显微镜下进行杯状细胞计数，每张切片在黏膜层选择10个视野，计数每个视野中的杯状细胞。

1.8统计学处理采用SPSS 20.0进行统计学分析。对照组和DSS组间结肠长度、血便评分、组织病理学评分、杯状细胞计数和3种炎症因子、Cyp4a14 mRNA相对表达量的比较采用两独立样本的t检验或校正t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1一般情况观察及DAI评分KO对照组和WT对照组小鼠每天摄食饮水正常，反应机警，皮毛光泽，体重均增加。KO DSS组小鼠于造模第4天开始出现摄食饮水减少、懒动、体重下降，并伴有稀便、肛周潮湿等现象；造模第6天可观察到数只小鼠出现血便，但体重下降未超过12%。WT DSS组小鼠于造模第3天相继出现摄食饮水减少、懒动、精神萎靡、体毛凌乱、稀水样便、血便以及肛周潮湿等现象；造模第6天，全部小鼠均出现严重肉眼血便，体重下降接近25%，但无小鼠死亡。与2个对照组相比，KO DSS组和WT DSS组DAI评分均增高，且WT DSS组增高更明显(图2)。

图2 各组小鼠体重变化(上)及DAI评分(下)比较

2.2结肠长度和血便评分WT对照组、WT DSS组结肠长度分别为(8.07±0.66)、(4.89±0.44) cm(t=11.000,P<0.001)。KO对照组、KO DSS组结肠长度分别为(7.52±0.61)、(5.22±0.47) cm(t=9.449,P<0.001)。WT DSS组、KO DSS组血便评分分别为(2.90±0.32)和(2.20±0.79)，WT对照组和KO对照组均无血便。

2.3结肠组织病理学观察、评分及杯状细胞计数KO对照组和WT对照组小鼠组织学观察可见结肠黏膜结构完整，无炎性细胞浸润现象，KO对照组小鼠结肠组织中杯状细胞数量较WT对照组明显增加；KO DSS组结肠黏膜腺体基本完整，杯状细胞大而不规则，胞浆内有少量分泌颗粒填充，杯状细胞数量减少，局部在镜下可以观察到少量炎性细胞浸润或者隐窝破坏，呈轻度炎症改变；WT DSS组镜下观察到黏膜上皮细胞广泛缺失，局部出现糜烂，腺体多数不完整，黏膜及黏膜下细胞结构排列紊乱，杯状细胞几乎消失，炎性细胞广泛浸润，呈严重炎症改变(图3)。各组小鼠结肠组织病理学评分及杯状细胞计数的比较见表2、3。

图3 各组小鼠结肠组织HE染色(A～D)和PSA染色(E～H)结果(×400)

组别组织病理学评分杯状细胞计数WT对照组0.61±0.2019.82±0.54WT DSS组10.70±0.482.10±1.20t61.16742.705P<0.001<0.001

表3 KO组小鼠组织病理学 评分和杯状细胞计数比较(n=10)

2.4结肠和肝脏组织中IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA的表达结果见表4～7。

表4 WT组结肠组织中IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA相对表达量的比较(n=10)

表5 KO组结肠组织中IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA相对表达量的比较(n=10)

表6 WT组肝脏组织中IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA相对表达量的比较(n=10)

表7 KO组肝脏组织中IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA相对表达量的比较(n=10)

2.5结肠和肝脏组织中Cyp4a14mRNA的表达无论是WT组还是KO组小鼠结肠组织中均检测不到Cyp4a14 mRNA的表达；WT DSS组小鼠肝脏组织中Cyp4a14 mRNA的表达较WT对照组下降[(1.0±0.1)和(9.3±0.1)，t=8.852，P<0.001]。

3 讨论

Cyp4a14蛋白的主要作用是参与脂肪酸代谢、调节脂质过氧化及氧化应激，从而参与炎症反应[9，14]。Cyp4a14在机体炎症反应过程中存在两种截然相反的作用：在严重感染过程中，机体通过降低Cyp4a14的表达达到自身稳态，在炎症损害发生之前削弱或终止炎症反应，保护机体避免感染等损害；然而，减弱的炎症反应有利于细菌侵入机体逃避免疫系统的清除，进而发展为更为严重的感染[15-17]。本研究结果显示，WT对照组和KO对照组小鼠生长发育良好，体重增加；KO DSS组小鼠出现稀便、肛周潮湿现象，体重下降；WT DSS组小鼠出现精神萎靡、血水样便，体重急剧下降。DAI评分、结肠长度、血便评分和组织病理学结果显示：与KO对照组相比，KO DSS组小鼠DAI评分增高，结肠缩短，出现结肠血性内容物，病理学呈轻度炎症改变；WT DSS组小鼠与KO DSS组相比DAI评分进一步增高，结肠缩短最多，出现全结肠血性肠内容物小鼠增多，病理学呈严重炎症改变。以上各方面结果显示Cyp4a14基因敲除后小鼠对DSS诱导的结肠炎反应敏感性下降，说明Cyp4a14基因的缺失会减轻小鼠结肠的炎症反应，与以往研究[17]结果一致。

肠道是人体最大的细菌储存器官和病原微生物、毒素侵入机体的主要门户，杯状细胞是肠上皮中的黏液分泌细胞，其分泌的黏液可发挥保护和润滑肠道的作用，是形成肠黏膜屏障的重要组成部分[18]。有研究[19-20]显示，寄生虫感染的小鼠结肠中IL-13和IL-14可导致杯状细胞病理性增生和黏蛋白过度分泌。当外界有病原体进入时，肠道做出应激反应，杯状细胞分泌黏液量增加，随着病程的发展，细胞数量逐渐下降，分泌能力也将下降，使肠道抵抗外界侵袭的能力减弱[21-22]。本研究中发现，KO DSS组小鼠结肠组织中杯状细胞数量多于WT DSS组，可能正是由于杯状细胞数量的增加，使KO DSS组小鼠结肠炎症反应轻于WT DSS组小鼠。

炎症性肠病患者及动物模型中肠道黏膜ROS及RNS产生均增加，且ROS常在疾病早期阶段出现，与疾病的严重程度及进展均有关[23]。ROS可以激活NF-κB，介导产生大量炎症因子，如 IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和IFN-γ等，促进炎症反应[24-26]。本研究中，在DSS诱导下，结肠和肝脏组织中IL-1β、IL-6和TNF-α表达均增加，且在结肠组织中的表达量均高于肝脏，尤其以IL-6为著。本研究中还发现，在KO和WT小鼠结肠组织中均检测不到Cyp4a14的表达，Cyp4a14主要表达在肝脏中。以上结果提示，肝脏组织中促炎因子的增加可能是通过肝肠循环由肠道炎症反应诱导而来。

总之，Cyp4a14基因的缺失对小鼠结肠炎症的发生具有一定的保护作用。这可能是由于Cyp4a14基因敲除影响了小鼠结肠组织中杯状细胞的分化，使肠道内杯状细胞数量增多，从而加强了肠道对外界刺激的抵抗能力。但Cyp4a14基因影响小鼠结肠组织杯状细胞分化的具体机制仍不十分清楚，尚需进一步研究。