老年性聋小鼠耳蜗带状突触损伤特点及机制研究

魏薇 杨丽辉 熊伟 柳柯,4 马秀岚 龚树生,4 杜政德*

1中国医科大学附属盛京医院耳科（沈阳110004）

2辽宁省人民医院耳鼻咽喉科（沈阳110016）

3首都医科大学附属北京友谊医院耳鼻咽喉科（北京100050）

4北京市临床医学研究所耳鼻咽喉头颈外科研究室（北京100050）

老年性聋(Presbycusis)又称为年龄相关性聋(Age-Related Hearing Loss,ARHL)，主要表现为双耳高频听力下降的感音神经性耳聋，是老年人第三大慢性常见疾病，其中70周岁以上约70%患有ARHL，而80周岁以上增加至80%，目前已经严重影响了老年人的生活质量[1-3]。因此，ARHL发病机制的深入研究，对防治ARHL意义重大。近来，研究发现耳蜗内毛细胞带状突触在ARHL发病发展过程中表现最为敏感，是小鼠耳蜗老化最早发生损伤的部位[4]。耳蜗带状突触是听觉传导系统中将声音向中枢传递的第一个突触结构，因其空间分布呈带状故称为带状突触(Ribbon Synapse)，耳蜗带状突触的功能决定了声音向中枢传递的质和量[5]。

耳蜗带状突触功能的维持依赖于囊泡的转运，是一个高耗能的量子式释放过程，需要内毛细胞线粒体的持续供能[6]。而在老化的过程中，线粒体氧化损伤增多，影响三磷酸腺苷（Adenosine Triphosphate,ATP）的生成[7]，进而影响耳蜗带状突触功能，可能是ARHL耳蜗带状突触损伤的病理生理机制。但在耳蜗老化过程中，耳蜗内毛细胞带状突触各回损伤的严重程度，及耳蜗带状突触损伤的具体机制均尚不明确。此外，体内活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）生成增多，可激活线粒体解偶联蛋白2（Uncoupling Protein 2,Ucp2）生成增多，Ucp2可减少负反馈调节ROS产生，但同时也减少了ATP的生成[8,9]。然而在老化过程中，Ucp2在耳蜗中的表达特点尚不清楚。

因此，本研究将利用ABR、免疫组织化学激光共聚焦显微镜成像等技术，检测ARHL耳蜗带状突触的数量变化及Ucp2的表达，并探讨Ucp2在年龄相关性耳蜗带状突触损伤中的可能作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

24只1月龄和12月龄雄性C57BL/6J小鼠（各12只）购自首都医科大学实验动物中心。两组动物均无噪声暴露史，无其它药物使用史。所有实验动物的处理严格遵守首都医科大学实验动物管理规定。

1.2 听功能检测

小鼠听功能检测采用美国TDT测听设备，分别检测1月龄和12月龄C57BL/6J小鼠8kHz，16kHz和32kHz时的双耳ABR阈值及Ⅰ波幅值。1月龄和12月龄组小鼠（每组6只）腹腔内注射氯胺酮（100 mg/kg）和盐酸赛拉嗪（10 mg/kg）麻醉，麻醉满意后，将小鼠移入隔声屏蔽室内，连接电极，记录电极插入颅顶正中皮下，参考电极插入测试耳耳垂处，接地电极置于对侧耳耳垂，测试电极距离外耳道口0.5cm，测试电阻小于3kΩ，调整给声喇叭贴近外耳道而不接触耳廓。以短纯音（Tone burst）作为刺激声，测试实验动物在8k、16k、32kHz各个频率ABR阈值和I波幅值，刺激强度从90dB SPL开始，以10dBL逐渐递减，以能分辨出可重复的ABR波Ⅱ的最低刺激强度判断阈值。

1.3 耳蜗带状突触计数

免疫组织化学染色标记耳蜗内毛细胞带状突触突触前蛋白Ctbp2，Ctbp2的数量用于耳蜗带状突触计数。颈椎脱臼法处死1月龄组和12月龄组小鼠（每组4只），快速取出耳蜗，放入4%多聚甲醛溶液。在解剖显微镜下，用细针在蜗顶钻孔，并开放圆窗和卵圆窗，用4%多聚甲醛溶液自蜗顶进行灌流，冲出淋巴液，4℃冰箱固定过夜。第二天，将标本置于10%乙二胺四乙酸（EDTA）溶液中脱钙2h后，在解剖显微镜下，用显微镊去除已脱钙的耳蜗蜗壳、外侧壁、前庭膜及盖膜，分离出基底膜。将基底膜置于0.3%Triton X-100+2%BSA（bovine serum albumin，牛血清白蛋白）中破膜和封闭30min，加入小鼠来源的Ctbp2（1：500稀释，BD Biosciences，美国）和标记内毛细胞的Myosin VIIa（1:500稀释，Abcam，美国）一抗4℃过夜，PBS冲洗3次；加入合适的二抗，37℃避光染色1h，PBS冲洗3次（5min/次），含DAPI（标记细胞核）的封片剂封片，激光共聚焦显微镜扫描和计数，激光共聚焦显微镜设定的扫描层距为0.35μm。

1.4 耳蜗Ucp2蛋白的检测

1月龄组和12月龄组小鼠（每组4只）颈椎脱臼处死后，快速取出双侧耳蜗，放入装有RIPA裂解液（碧云天，中国）中，于冰上研磨耳蜗组织，4℃12000rpm/min离心25min提取总蛋白，取上清并用BCA法进行蛋白定量。将蛋白样品上样于SDS-PAGE凝胶不同泳道的电泳孔中，用电压80V跑过浓缩胶后转换电压至120V，待溴酚蓝位于凝胶底边，改用恒流200mA将目的蛋白转于PVDF膜上，然后用含5%脱脂牛奶的TBST缓冲液室温下封闭2小时，再加入一抗anti-Ucp2（1:500稀释，Abcam，美国）、anti-GAPDH（1:1000,CST,美国），4℃过夜。第二天，用TBST缓冲液洗膜3次（5min/次），加入HRP标记的二抗（1:5000,中杉金桥，中国），室温下摇床孵育1小时，再次用TBST缓冲液洗膜3次（5min/次）。在暗室内使用ECL发光液A,B（碧云天，中国）按1:1比例混合，加至PVDF膜上，放入暗盒内，压片曝光。对曝光好的胶片进行固定、扫描和保存，用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件（Media Cybernetics,Inc.,美国）进行半定量分析，以GAPDH为内参照物。

1.5 统计学方法

所有实验数据采用SPSS 13.0（SPSS Inc.,美国）统计软件行两个独立样本的t检验，所有实验数据用平均值±标准差表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 12月龄C57BL/6J小鼠听功能损伤特点

1月龄C57BL/6J小鼠在8 kHz、16 kHz和32 kHz的ABR阈值分别为22.50±6.45 dB SPL、28.75±4.79 dB SPL和61.25±4.79 dB SPL；12月龄C57BL/6J小鼠在8kHz的ABR阈值为72±5.70 dB SPL，比1月龄小鼠明显升高（t=12.226,P＜0.01），见表1，在16kHz和32kHz ABR阈值大于90dB SPL（图1C）；1月龄组和12月龄组小鼠8kHz的ABR阈值波形图见图1A、B；12月龄小鼠90dB SPL声场强度下的8kHz的 ABR I波幅值为0.54±0.14μV，1月龄组小鼠 8kHz、16kHz、32kHz在 90dB SPL 声场强度下8kHz、16kHz、32kHz的ABR I波幅值分别为0.95±0.09μV、0.72±0.30μV、0.39±0.25μV（图1D），12月龄组小鼠与1月龄组相比，在90dB SPL声场强度下8kHz的ABR I波幅值显著降低，差异有统计学意义（t=5.102,P＜0.01）。

表1 1月龄组和12月龄组C57BL/6J小鼠听力阈值变化(x±s)(dB SPL)Table 1 The alterations of hearing threshold betwen 1-Month and 12-Month group(x±s)(dB SPL)

图11 月龄和12月龄C57BL/6J小鼠听功能（A/B）1月龄组和12月龄组小鼠8kHz的ABR波形图；（C）1月龄组和12月龄组在8kHz、16kHz、32kHz的ABR阈值；（D）1月龄组和12月龄组小鼠在90dB SPL声场强度下ABR I波幅值(**P＜0.01)。Fig.1The ABR waveform and threshold,ABR waveⅠamplitude testing in the condition of 90 dB SPL.(A/B)ABR threshold waveform at 8kHz of 12-month and 1-month group；（C）The ABR threshold of 8kHz,16kHz and 32kHz of 12-month and 1-month group;(D)ABR WaveⅠAmplitude in the condition of 90dB SPL between 12-month and 1-months group(**P＜0.01).

2.2 12月龄组小鼠耳蜗带状突触数量下降

1月龄组和12月龄组小鼠耳蜗基底膜铺片，用特异性标记耳蜗内毛细胞带状突触前抗体Ctbp2检测发现：1月龄组小鼠耳蜗顶中底回平均每个内毛细胞带状突触数量分别为14.6±1.14、17.2±2.16、15.8±1.64；12月龄组小鼠耳蜗顶中底回平均每个内毛细胞带状突触数量分别为7.0±1.0、10.6±3.78、3.8±0.83（图2），12月龄小鼠耳蜗带状突触数量与1月龄组相比各回均显著减少，其中底回减少最明显（t=17.076,P＜0.01），其次是顶回（t=10.230,P＜0.01）和中回（t=3.386,P＜0.05）。

图21 月龄和12月龄C57BL/6J小鼠耳蜗带状突触数量（A）耳蜗基底膜铺片Ctbp2（红色）标记耳蜗带状突触突触前，Myosin VIIa（绿色）标记内毛细胞（IHCs）和外毛细胞（OHCs）细胞浆，DAPI（蓝色）标记IHCs和OHCs细胞核；（B）定量分析平均每个内毛细胞带状突触数量(*P＜0.05,**P＜0.01)。Fig.2 Cochlear basal membrane in confocal microscope and quantitative analysis of the ribbon synapse number.(A)Representative images showing the quantity and localization of Ctbp2(red)protein of cochlear ribbon pre-synapse in the cochlear basal membrane;Myosin VIIa(Green)indicating the cytoplasm of inner hair cells(IHC)and out hair cells(OHC);DAPI(blue)indicating the nucleolus of IHCs and OHCs.(B)Analysis the number of ribbon synapse for per inner hair cell.(*P＜0.05,**P＜0.01)Scale bar：10μm

2.3 12月龄组小鼠耳蜗Ucp2蛋白水平表达明显下降

图3 1月龄和12月龄C57BL/6J小鼠耳蜗线粒体Ucp2的表达（A）Western blot检测1月龄组和12月龄组小鼠耳蜗Ucp2蛋白的表达；（B）定量分析两组Ucp2蛋白水平的表达差异(**P＜0.01)。Fig.3 The protein expression of mitochondrial Ucp2 in cochlea.(A)Representative image showing the protein expres-sion of Ucp2 in the cochlea of different groups using Western Blot between 12-month group and control group;(B)Quantification of the Ucp2 protein expression in the cochlea between 12-month group and control group(**P＜0.01).

为定量分析ARHL衰老小鼠Ucp2蛋白表达，我们利用Wstern Blot技术检测了两组小鼠耳蜗线粒体Ucp2蛋白表达（图3A）。结果显示12月龄组小鼠耳蜗Ucp2蛋白水平是1月龄组的4.58±0.49倍（图3B），12月龄耳蜗Ucp2比1月龄组显著升高（t=11.429,P＜0.01）。

3 讨论

C57BL/6J小鼠耳蜗毛细胞从成年期开始出现退变，12月龄时开始出现显著的听力损失及耳蜗退行性改变，是目前最理想的ARHL动物模型之一[10-12]。耳蜗内毛细胞带状突触在听觉形成和听力损失的过程中意义重大，它是将声音从外周向中枢传递的第一个传入性突触结构，是声音信号从外周向中枢传递的重要节点，任何因素如老化、噪声及耳毒性药物等都会引起带状突触数量、形态及功能的改变，进而影响声音传递的质量。李晓瑞等[13]发现与2月龄小鼠相比，6月龄小鼠耳蜗带状突触数量减少主要发生在底回，10月龄小鼠带状突触数量在各回均明显减少，而12月龄小鼠顶、中回继续减少，底回反而稍微增多。Rui等[14]发现FBN大鼠在20月龄时带状突触数量开始减少，在第24、28个月龄时，4kHz基底膜区域（底回）突触数量显著减少，12kHz、24kHz基底膜区域（中回、顶回）突触数量无显著变化。而在105dB、8-16kHz、60min噪声暴露下，FVB/nJ小鼠在12kHz和24kHz区域(中、顶回)中的突触数量均减少，其中顶回减少更显著[15]。此外，Ke等[16]研究证实在耳毒性药物作用下，C57BL/6J小鼠耳蜗带状突触数量底回减少最明显，其次是中回、顶回。总之，目前耳蜗各回带状突触损伤严重程度尚存在很大争议，而本研究证实相对于1月龄组，12月龄组老年性C57BL/6J小鼠耳蜗带状突触数量损伤底回最为严重，其次是顶回和中回。

耳蜗内毛细胞带状突触在听觉系统发挥功能主要依赖于突触前膜囊泡精准地转运、聚集以及释放[6]，这个过程需要耳蜗内毛细胞线粒体产生大量ATP供能，因此突触功能的维持需要线粒体的持续供能[17-19]。ABR I波幅值可反映耳蜗带状突触的功能，在本研究中12月龄组在90dB SPL声强强度下的I波幅值显著低于1月龄对照组，与以往研究结果相一致[20]，提示很可能是线粒体能量代谢紊乱，导致耳蜗带状突触功能下降，进一步诱发ARHL的发生与发展。

ARHL是一种机体退行性病变的慢性过程，老化机制十分复杂，目前研究证实线粒体功能紊乱及氧化应激损害与ARHL关系最为密切[21,22]。而解偶联蛋白（Uncoupling proteins,Ucps）是一类位于线粒体内膜上参与质子转运的蛋白家族，在ROS生成增多的情况下，可限制ATP的合成，并参与丙酮酸的转运，最终将能量以热形式消耗进而调控能量代谢[23]。Ucp2在Ucps家族成员中分布最广，主要通过发挥“质子漏”的功能，即降低线粒体内膜的质子梯度，减少ROS的产生，进而减轻了氧化应激反应，但同时也降低了ATP的产生[24]。在本研究中，我们通过Western Blot发现12月龄组小鼠耳蜗Ucp2的表达量明显增多，显著高于1月龄组。因此，我们推测在ARHL过程中，耳蜗内氧化应激ROS损伤增加，启动Ucp2保护机制减少了ATP的合成，从而诱发ARHL耳蜗内毛细胞带状突触的损伤。因此，本研究结果为以后的ARHL耳蜗带状突触损伤的机制研究提供了新的思路。

综上所述，在ARHL发生发展过程中，早期可出现线粒体功能紊乱与耳蜗内毛细胞带状突触损伤，其中耳蜗底回带状突触损伤最明显，其次是中回及顶回。此外，本研究中Ucp2在12月龄老年鼠耳蜗中表达量明显增高，推测Ucp2可能通过降低线粒体ATP合成，进而影响耳蜗带状突触正常功能的维持，最终导致ARHL耳蜗带状突触功能的降低和数量的下降，本研究的发现将有望在未来老年性聋的防治过程中发挥重要作用。