中-低强度噪声暴露对耳蜗带状突触的影响

王园园 孙毓晗 柳柯 孔婷婷*

1牡丹江医学院附属红旗医院耳鼻咽喉头颈外科(牡丹江157011)

2首都医科大学附属北京友谊医院耳鼻咽喉头颈外科(北京100050)

3北京市临床医学研究所耳鼻咽喉头颈外科研究室(北京100050)

噪声性听力损失(Noise induce hearing loss，NIHL)又称噪声性耳聋(Noise induced deafness)，是因长期暴露于损害性噪声环境所致内耳毛细胞损伤为主要机制的一种感音神经性耳聋[1]。近些年，随着社会工业化和现代化的发展，噪声污染日益严重。据估计，全球超过12%的人口面临着听力损失的风险，其中三分之一病例可归因于噪声暴露[2]。在传统观念上，噪音暴露或衰老导致的“听力损失”常会引起听觉阈值的改变，这种阈值的升高一般认为是由毛细胞受损造成的。然而近些年的临床和基础研究则显示很多情况下的听力损失并不一定伴随阈值的升高，或者阈值在升高一段时间后又恢复至正常水平。这种发现对解释目前临床上一些较为棘手的听觉问题提供了新的视角，也为未来的听觉疾病研究提供了新的线索。本文将对近年来国内外对中-低等强度噪声暴露对耳蜗带状突触可塑性影响的文献进行简要综述。

1 耳蜗带状突触特征

神经细胞依赖于神经突触(synapses)进行细胞间信息传递[3]。在电镜下观察到，突触部位有两层膜性结构，分别为突触前膜和突触后膜，两膜之间为突触间隙。在靠近前膜的突触囊泡内含有神经递质，外界声音刺激后，突触前膜发生去极化，使神经递质从突触前释放到突触间隙中，与突触后膜上的谷氨酸受体相互作用，从而完成声音信号在听神经上的兴奋性传导[4]。内毛细胞周围的支持细胞膜上具有谷氨酸-天冬氨酸转运体(GLAST)，当谷氨酸过量时，GLAST将过多的谷氨酸转运入细胞内，在谷氨酸合成酶的作用下合成谷氨酰胺，从而维持突触间隙谷氨酸的平衡[5]。

1.1 带状突触超微结构

Ribbon突触是突触前膜的一种带状电子致密物，这种致密体周围由谷氨酸填充的突触囊泡附着，因其呈带状而被命名[6，7](如图1)。研究表明，小鼠在出生时，内、外毛细胞上即可观察到可标记的突触信号，该信号呈大小不等圆点状，不均匀地分布于毛细胞胞质和基底侧膜上[8]。内毛细胞通过带状突触将不同的声音信号传递给听觉传入神经，不同强度及频率的声音刺激产生不同程度的去极化，此时突触带状体结构可保证与刺激方式相匹配的神经递质释放活动，从而确保声刺激信号的差异化在兴奋性传导过程中得到维持（fidelity），这正是耳蜗对声音信号编码的本质特征之一。

早在1955年，De Robertis和Bennett等[9]首先在豚鼠视网膜的突触前膜发现了一种颗粒状或泡状结构，定义为“突触囊泡”。1956年，De Robertis[9]在兔视网膜光感受器的研究中发现了突触囊泡的数量与突触前膜活动相关性的首个实验证据。在电镜下观察到，突触前膜和突触后膜的厚度一般只有7nm左右，间隙为20nm左右。在靠近前膜的轴浆含有线粒体和突触囊泡，囊泡的直径为30～60nm。有学者观察到，哺乳动物耳蜗带状突触上可以聚集100-200个突触囊泡[10]。形态上，突触囊泡可分为三种类型:I、锚定囊泡(docked vesicle）:即囊泡与突触的浆膜层紧密相连；II、与带状突触相连的囊泡(ribbon-associated vesicle)；III、游离的突触囊泡(free cytosolic vesicle）[11]。

图1 带状突触形态：a、b、c为8周龄小鼠毛细胞带状突触电子显微图（带状结构附着在质膜上，周围是突触囊泡）；d为用电子断层扫描重建的蛙毛细胞突触截面；e为突触三维结构[7]。Fig.1 morphologyofribbonsynaptic：a,bandcaretheelectron micrographs of ribbon synapses in hair cells of 8-week-old mice(ribbons attached to the plasma membrane,surrounded by synaptic vesicles)；d are the synaptic sections of frog hair cells reconstructed by electron tomography；e is the three-dimensional structure of synapses[7].

1.2 带状突触形态及数量

带状突触多存在于动物视网膜视杆细胞、视锥细胞、双极细胞，内毛细胞及松果体细胞中，具有形态特异性，其形态可以为球形、椭圆形或长方体形[11]，大小不一。非哺乳类动物毛细胞带状突触直径为200-400nm，而哺乳类动物毛细胞带状突触直径≤200nm[12]。在哺乳动物耳蜗中，不同的空间位置和生理状态下,带状突触的形态、大小及数量均有所不同，甚至在同一动物的不同发育阶段也会有很大差异[13]。毛细胞的形态与其功能性质也有一定相关性，耳蜗高频和低频区域上带状突触的结构不同，导致了空间分布不同的带状突触的胞吐作用对钙离子的依赖性不同，研究发现高频区域的带状突触表面积更大[14]。在小鼠耳蜗中，每个IHC一般有10-20个带状突触，每个突触结构与不同的I型神经元末梢接触[15]。柳柯等[16]应用三维建模方法定量分析小鼠耳蜗内带状突触的数量，发现每个内毛细胞带状突触数量平均为（16.10±1.032）个，与之前研究人员证实的内毛细胞带状突触数量平均值近似。

1.3 带状突触的分子组成

由于耳蜗带状突触标本取材难度较大，因而对其组成的研究较少。近年来已知的哺乳动物带状突触的蛋白结构主要包括Ribeye,Bassoon,Piccolo,Rab3,KIF3A，Shank1以及PSD95等[17]。目前对这些蛋白结构在带状体上的功能还不是很明确，研究人员倾向认为它们可能是听觉传入的重要调节因子。其中Ribeye是带状突触上唯一已知的结构蛋白，脊椎动物Ribeye蛋白均为C-末端的结合蛋白（CtBP2）基因的亚型[7]，羧基端的B结构域与CtBP2具有同源性，独特的氨基端A结构域富含脯氨酸，目前猜测其作用可能是构成带状突触结构的骨架蛋白，然而在已知的基因库里尚未发现其同源基因[18]。Rab3反应蛋白对于启动囊泡释放和Ca2+依赖性囊泡释放具有重要的作用[19]。Bassoon蛋白位于突触前膜活性区和带状体之间，推测其作用同Piccolo蛋白相似，可能与将带状体锚定于活性区有关[14]。KIF3A是驱动蛋白Ⅱ的构成部分[20]，因在带状突触上只找到了KIF3A，而未找到驱动蛋白Ⅱ的其他构成部分，因此该蛋白对带状突触的具体功能至今还不清楚。

1.4 带状突触可塑性

带状突触属于一种动态变化的神经结构，其结构改变可由自身因素或外界环境改变所引起。即使在同一种细胞类型上，突触的数量、形态、结构、功能也可能不同。Ribeye蛋白的表达量和带状体的体积均与其结构的可塑性相关[21]。带状突触结构的改变也反映了其功能的变化。在噪声暴露时，耳蜗带状突触的数量会即刻出现变化，随着时间的延长或暴露强度的降低，带状突触的数量会逐渐恢复。黑暗条件下视网膜上带状突触释放大量神经递质，此时带状突触体延伸变长；光照条件下视网膜上带状突触收缩变短，突触的胞吐功能降低[21]。

2 噪声暴露及内耳信号传导

声音刺激后，耳蜗内毛细胞将声音刺激所致的基底膜振动转化为膜电位变化，导致神经递质在突触区释放，激活传入听神经纤维兴奋性神经冲动。每根听纤维通常不分支，并仅与一个IHC形成突触连接。研究表明每个IHC由10-20个听觉神经末梢支配，其中约50%的神经末梢即使在阈值无改变的情况下也可受到损伤并消失[11，22]。噪声根据其暴露强度分为不同等级，一般认为，声强大于110dB的为强噪声，低于110dB的为低中等强度噪声。目前噪声所致感音神经性耳聋(SNHL)的相关研究较多，但由于噪声性耳聋的病理机制十分复杂，涉及多器官、多部位以及多个分子通路，其确切的机制现在仍不明确。多数人所认同的是，噪声性耳聋首先出现Corti器的机械性损伤改变，后继发耳蜗内局部组织的多种病理性改变，其中最主要的是毛细胞代谢及神经功能异常。近年研究发现，不同强度和种类的噪声以及耳毒性药物都可以对耳蜗带状突触造成损害。

3 耳蜗带状突触是中-低强度噪声损害重要靶点

早些年对噪声诱导的永久性阈移(PTS)研究发现，噪声暴露会对Corti器与SGNs产生损害[23]。一定强度噪声暴露可导致耳蜗IHCs底部区域出现广泛肿胀和空泡化，这些肿胀和空泡结构与可识别的突触前结构连接；在暴露后较长时间点再次观察，发现IHCs底部区域肿胀消失或减轻，此时听觉阈值已恢复正常，耳蜗神经轴突或螺旋神经节细胞也无明显丧失，人们因此认为这些噪声损伤的神经末梢已经恢复或再生[24]。但近年来，多项动物研究发现，当噪声诱导的阈值变化和毛细胞损伤完全可逆时，IHCs和听神经纤维之间的许多突触连接可能被永久性破坏[25，26]。这种现象已在小鼠[26]、豚鼠[27]和人类[28]个体上得到证实。

过度的噪声刺激会引起自由基或活性氧(ROS)的形成及谷氨酸的兴奋性毒性作用，随后信号通路的激活导致细胞死亡[29]。ROS在噪声暴露后立即出现，存在于Corti器的基底膜上，并可持续存在7-10天，因此增大了细胞受损的可能性[1,30]。谷氨酸除了对突触后膜具有快速兴奋性和营养作用之外，在缺血和噪声损伤的病理状态下还对突触后膜和邻近支持细胞具有损害作用[31]。暴露于噪声刺激后，IHC突触前膜会释放过量的谷氨酸，持续作用于突触后膜的谷氨酸特异性受体[32]，继而造成耳蜗传入神经Ca2+超载，产生胞内渗透压失衡以及兴奋性毒性[33]，引起突触后神经纤维肿胀，甚至变性、凋亡[34]。内毛细胞损伤后，谷氨酸的释放减少，缺乏营养支持，又会引起突触后膜的退行性改变。Zheng,X Y等[35]发现经一种谷氨酸的类似物Kainic Acid(KA)干预后，同样可以诱导产生耳蜗的兴奋性毒性，低浓度的KA可造成耳蜗传入神经元部分可逆性损伤，此时部分兴奋毒性损伤的耳蜗传入神经元可与IHCs建立新的突触连接[36]，超过一定水平的KA会引发不可逆的渐进性神经退行性变[37]。有作者提出当突触间隙谷氨酸堆积，将过度激活突触后膜上的谷氨酸受体，导致高阈值听神经纤维末梢发生永久性损坏[25]，但是大量噪声导致暂时性阈移(TTS)的实验研究证实，突触后膜因过量谷氨酸盐释放被暂时破坏后，新的突触后膜可以重新生长并与内毛细胞重新恢复突触联系从而使听觉功能得到恢复。

Lin,Harrison W等[27]将豚鼠在106dB SPL白噪声下暴露2小时后，2-24小时内测得ABR阈值偏移40-50dB，但在1-2周内ABR阈值可完全恢复，并通过对突触带和突触后致密物（PSDs）的动态观察发现：突触带与PSDs的计数变化相平行，在噪声暴露后，其数量均减少，在1月内可部分恢复，其中有10%的损伤是不可逆的。研究发现噪声暴露后会出现突触带与PSDs不配对的现象，刚修复的带状体在IHC靠近细胞核的较高部位，体积也相对增大，而幸存的PSDs却保持在底部位置，随后带状体似乎由于突触后结构的吸引逐渐向IHC底部移动，并重建突触联系[27，38]。石丽娟等[38]将豚鼠在105dB SPL白噪声下暴露2小时发现，ABR阈值可有一过性升高，初期突触数量明显下降，但随着时间的延长，突触的数量可有不同程度的恢复，与此相对应，CAP幅度先下降，后期不完全恢复，这提示中-低强度噪声能导致带状突触的永久性损伤，但随着时间的推移部分突触可以自行修复，由于残存或修复的突触存在功能缺陷，从而影响其对声音的编码能力。宋峰等[39]将豚鼠暴露在95dB SPL白噪声下4小时，连续暴露7天后形态学观察显示：突触数量减少主要分布在距基底膜顶端60-80%区域，对应频率范围为5-20kHz，这与听阈改变的频率相对应。此研究同时也显示噪声暴露后突触前带状体、突触后致密物及其匹配的突触数量的恢复情况不一致，且突触前损伤重于突触后受损，在之后的修复过程中，近蜗轴侧的突触前结构更趋集中，同时配对的突触数量增多。杨乐等[8]将小鼠长时程暴露于噪声中(70dB SPL，8h/天)，暴露3个月后表现为全频不同程度的听力减退，ABR的I波幅值明显降低，其中以听觉频谱的中间频率（8-16kHz）受累显著，突触的减少也以耳蜗中间区域为甚。另一个实验中，Furman AC等[40]发现经过106dB SPL白噪声暴露2小时后的豚鼠，2周后ABR和DPOAE阈值完全恢复正常，但内毛细胞上有多达30%的听神经突触缺失，暴露后动物在高频(32kHz)区域的听神经末梢的病理改变也难以完全恢复，表明噪声对听神经纤维损伤具有空间选择性，进一步研究人员推测这种损伤的选择性可能与噪声诱导所致隐匿性听力损失患者在嘈杂环境中的言语识别率下降有关。

柳柯等[41]发现将小鼠暴露于较强噪声后(120dB SPL，2h)，可导致小鼠耳蜗外毛细胞纤毛受损，并形成永久性阈移，带状突触计数明显下降，但在2周后突触数量有少量恢复，这提示带状突触在强噪声下仍有自我修复和保护机制。

4 中-低强度噪声暴露耳蜗带状突触损伤的预防与治疗

从上述研究中我们发现，中-低强度噪声可造成可逆性听觉阈值变化，随着时间推移，这种阈值变化可恢复至初始状态。虽然带状突触数量会有明显减少和不完全恢复，但并不会导致以听阈为主要评价指标的听力水平发生严重损害。在现代社会中，由于暴露于低水平噪声的现象普遍存在，这种损伤在耳蜗的累积可能成为老年人听觉分辨率降低的机制之一[42]，也是随着年龄增长而出现语音感知问题的主要因素。目前预防中-低强度噪声暴露听觉损害最有效方法仍然是物理衰减其进入内耳。今后在实践中，可能需要加强以下几个方面的工作：1）首先需要严格执行国家规定的各类噪声控制设计规范，落实噪声限值和防护距离标准；2）需加强宣教，在条件允许的情况下使用听力保护装置及设备，并对噪音源进行最大程度的隔离；3）最新研究表明，即使70dB SPL甚至更低强度的噪声长期暴露依然可以显著损害听觉功能，因此需要将最新研究与民众和城市管理者分享，参考新的研究成果修改或更新城市噪声防护策略；4）对于存在听功能异常但听觉检测阈值正常的患者需要进行更加全面的听功能检测和评估；5）对于长期中-低强度噪声暴露并处于隐匿性听力损失状态的患者，恢复突触功能的药物或其它治疗方法可能具有实际效果，但是此类药物距离实际应用依然任重道远，还需要在安全性、有效性等方面进行大量的试验工作。