藏药千里光膏饮片的质量标准研究

达娃卓玛，罗华秀，旺杰次仁，巴桑卓嘎，王晓玲

(1.西藏自治区食品药品检验研究院，西藏 拉萨850000；2.西南民族大学药学院，四川 成都610041)

藏药千里光膏饮片为采自西藏地区的菊科千里光属植物川西千里光(Senecio solidagineus Hand. -Mazz.)水提取浓缩的干浸膏.制备方法是将风选干净的川西千里光药材打粉，加入锅中，加适量的水，进行煎煮后取上清液，药渣再加适量水煎煮后取出上清液，通过三次的煎煮取上清液后，去除药渣，而后将上清液进行浓缩熬制成干浸膏饮片.《中国植物志》以及《藏药志》中记载该植物具有清热、解毒、治疮、接骨等功效，全草入药可用于治疗跌打损伤、伤口化脓、肿胀疼痛、急性结膜炎、皮炎、疮疖等症状[1-2]. 藏药千里光膏饮片在西藏地区主要用于愈合创伤、清热解毒、清肝胆诸热等症状.

川西千里光成分研究方面比较全面，文献报道，该植物含有黄酮、生物碱、有机酸、倍半萜类成分[3-4].本课题组研究发现千里光膏饮片中富含绿原酸，而且是膏体中的主要成分. 大量研究表明该成分具有对自由基的清除及抗脂质过氧化作用[5-7]、抗肿瘤作用[8]、保肝利胆作用[9]、抑菌[10-11]等多种活性.为了快速有效地鉴定千里光膏饮片中绿原酸成分以及测定其含量，本实验采用TLC 法对饮片中绿原酸进行定性鉴别，采用SPE 技术富集样品溶液中的绿原酸，HPLC 法测定其在千里光膏饮片中的含量.SPE 技术作为样品前处理技术，已成熟用于萃取、浓缩和净化液体样品中的半挥发性和不挥发性化合物[12-15]，且净化效果好，回收率高. 对该民族药化学成分及质量标准化的研究，有利于阐明该民族药药效物质基础，为全面评价和控制该药质量提供参考.

1 仪器与材料

1.1 仪器

久品中药粉碎机(JP -500C -8 型，永康市久品工贸有限公司)；电子天平(BSA124S-CW 型，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；去离子超纯水机(HT-RO-60L/H 型，上海滨特环保科技有限公司)；双列四孔水浴锅(DK -S24 型，上海精宏试验设备有限公司)；旋转蒸发仪(RV8V-C 型，上海言合仪器科技有限公司)；超声波清洗机(JP -040S 型，深圳市洁盟清洗设备有限公司)；移液枪(500 -5000 μL，Sartorius)；微量点样针(上海高鸽工贸有限公司)；紫外灯分析仪(ZF-I 型，上海顾村电光仪器厂)；Waters 2695/2996 高效液相色谱仪.

1.2 材料

对照品绿原酸(批号:PS000627)购于成都普斯生物科技有限公司，经面积归一化法测定，质量分数为98.84 %.供试品千里光膏饮片收购于西藏3 个厂家(批号分别 为:160401、160402、160403、16062301、16062302、16062303、Y -16062801、Y -16062802、Y-16062803、Y-16062804).甲醇、乙腈(色谱纯)、超纯水、其余试剂纯度均为国产分析纯，硅胶薄层板GF254(青岛海洋化工有限公司)，Waters SunFireTM C18 色谱柱(4.6 mm × 150 mm，5 μm)；SPE 柱(Waters Sep - Pak © Vac 20 CC (5g) C18 Cartridges)；0.45 μm 微孔滤膜(上海泰坦科技公司).

2 方法与结果

2.1 绿原酸的TLC 鉴别

将千里光膏饮片固体样品打成粉末并过2 号筛，放置于烘箱中45 ℃烘2 h 后，放至室温.快速并精密称取1.0 g 样品粉末，置具塞锥形瓶中.精密量取新鲜配制的70 %甲醇20 mL，加入样品中，常温超声处理15 min，放置室温后，摇匀并过滤，取续滤液作为供试品溶液.另精密称取绿原酸对照品5.0 mg 于10 mL容量瓶中，加入新鲜配制的70 %甲醇制成每l mL 含0.5 mg 的溶液作为对照品溶液. 绿原酸的TLC 鉴别照薄层色谱法(《中国药典》2015 年版四部通则0502)试验[16]，微量点样针分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各1 μL，点于同一硅胶薄层板(GF254)上，以乙酸丁酯-丙酮-甲酸-水(5:4:1:1)为展开剂，饱和10 min，然后展开8 cm，取出，热风吹干，置紫外灯(365 nm)下检视.薄层色谱中，样品与对照品对应的位置处显相同的亮蓝色荧光斑点，各批次之间差别不大(图1).

图1 10 批样品和对照品TLC 图1 -10:样品批号160401、160402、160403、16062301、16062302、16062303、Y-16062801、Y-16062802、Y-16062803、Y-16062804；11:绿原酸对照品Fig.1 TLC chromatogram of 10 batches of samples and reference substance

2.2 绿原酸含量测定

2.2.1 色谱条件

采用Waters SunFireTMC18(4.6 mm × 150 mm，5 μm)色谱柱，流动相为乙腈-0.1 %甲酸水溶液(19:81)，体积流速为1.0 mL·min-1，检测波长327 nm，柱温25 ℃，进样量10 μL，理论塔板数按绿原酸峰计算应不低于5 000.在上述色谱条件下，得出对照品及10 批千里光膏饮片供试品的色谱图(图2).

图2 对照品和10 批样品含量测定HPLC 图谱Fig.2 HPLC chromatogram of reference substance and 10 batches of samples

2.2.2 对照品溶液的制备

精密称取10.0 mg 绿原酸放入50 mL 容量瓶中，用10 % 甲醇定容到刻度，摇匀，即得质量浓度为0.2 mg·mL-1，溶液用0.45 μm 微孔滤膜过滤，滤液作为对照品溶液.

2.2.3 供试品溶液的制备

将千里光膏饮片固体样品打成粉末并过2 号筛，放置于烘箱中45 ℃烘2 h 后，关闭温度放至室温.快速并精密称取1.0 g 样品粉末，放置于具塞锥形瓶中.精密量取新鲜配制的10 %甲醇20 mL，加入样品中，常温超声处理15 min(500 W，40 kHz)，放置室温，过滤，滤液用10 %甲醇定容至25 mL，摇匀，精密吸取3 mL 溶液过SPE 柱，用10 %甲醇溶液冲柱，收集最先馏出的30 mL 馏出液，旋蒸仪45 ℃抽真空旋干，残留物用10 %甲醇溶解并定容至10 mL 容量瓶中，溶液用0.45 μm 微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液.

2.2.4 线性关系考察

分别精密吸取“2.2.2”项下对照品溶液2、4、6、8、10 mL，置5 个10 mL 容量瓶中，用10 %甲醇定容至刻度，摇匀，即得质量浓度分别为0.04、0.08、0.12、0.16、0.2 mg·mL-1. 溶液用0.45 μm 微孔滤膜过滤，滤液作为样品溶液.按“2.2.1”项下液相色谱条件进样，测定绿原酸色谱峰峰面积. 以质量浓度为横坐标，色谱峰峰面积为纵坐标，进行线性拟合，得出绿原酸的线性回归方程为y ＝3E ＋07x – 145761(R2＝0.9991)，线性范围为0.04 ～0.2 mg·mL-1.

2.2.5 精密度试验

试验样品溶液为上述“2.2.2”项下对照品溶液，按“2.2.1”项下液相色谱条件连续进样6 次，记录每次的绿原酸色谱峰峰面积，计算得出绿原酸峰面积的RSD 值为0.66 %，表明该试验仪器精密度良好.

2.2.6 重复性试验

按“2.2.3”项下千里光膏饮片供试品溶液的制备方法，精密称取同一批次千里光膏饮片样品粉末6份，按“2.2.3”项下千里光膏饮片供试品溶液的制备方法平行制备样品溶液，按“2.2.1”项下液相色谱条件进样，记录绿原酸色谱峰峰面积，得出绿原酸RSD值为1.63 %，表明该试验重复性良好.

2.2.7 稳定性试验

按“2.2.3”项下千里光膏饮片供试品溶液的制备方法，精密称取同一批次千里光膏饮片样品粉末制备样品溶液，按“2.2.1”项下液相色谱条件进样，分别在0、2、4、6、8、12、24 h 进样，记录绿原酸色谱峰峰面积，得出绿原酸RSD 为1.06 %，表明样品溶液在24 h 内不变质，稳定性良好.

2.2.8 加样回收率试验

精密称取已知绿原酸含量的同一批次千里光膏饮片样品粉末6 份，每份1. 0 g，分别精密加入“2.2.2”项下质量浓度为0.2 mg·mL-1的绿原酸对照品溶液2 mL，按“2.2.3”项下千里光膏饮片供试品溶液的制备方法制备样品溶液，按“2.2.1”项下液相色谱条件进样，计算加样回收率，得出绿原酸平均回收率为107.40 %，RSD 为2.45 %.

2.2.9 定性限及定量限

按“2.2.1”项下液相色谱条件进样一针空白，得出和绿原酸保留时间一致处的基线噪音值.精密吸取“2.2.2”项下对照品溶液，用10 %甲醇逐级稀释至信噪比S/N ≈10，得出绿原酸的定量限为0.0113 mg·mL-1，S/N ≈3 时，得出绿原酸的检测限为0.0072 mg·mL-1.

2.2.10 样品测定

分别称取10 批千里光膏饮片样品粉末1.0 g，按“2.2.3”项下千里光膏饮片供试品溶液的制备方法制备样品溶液，每批样品平行制备样品3 份，按“2.2.1”项下液相色谱条件进样，得到绿原酸的峰面积值，代入“2.2.4”项下回归方程计算每批千里光膏饮片中绿原酸的含量(表1).

表1 千里光膏饮片中绿原酸测定结果(n ＝3)Table1 Determination of chlorogenic acid in Senecio solidagineus Hand. -Mazz. extracts (n ＝3)

3 讨论

3.1 样品溶液提取方法和色谱条件的优化

分别考察了用不同比例甲醇作为提取溶剂的提取效果，确定10 %甲醇作为提取溶剂提取效果最优.通过对常温超声、80 ℃水浴回流2 种提取方法进行考察，确定采用10 %甲醇常温超声提取效果最佳.在提取时间的选择上，对超声时间10、15、20、25、30 min进行考察，HPLC 结果显示超声时间为15 min 时，绿原酸百分含量最高，表明绿原酸已提取完全，且随着超声时间的延长，对提取结果并无显著影响，所以最终确定样品溶液提取方式为10 %甲醇常温超声处理15 min.在选择流动性时，甲醇-水系统与乙腈-水系统相比较，发现乙腈-水系统呈现更好的分离度，较短的分析时间以及较低的柱压，0.1 %甲酸水溶液与0.5 %磷酸水溶液相比较，0.1 %甲酸水溶液在优化峰型方面较0.5 %磷酸水溶液效果好，所以最终确定HPLC 试验流动性为乙腈-0.1 %甲酸水溶液.

3.2 样品提取液的纯化方法考察

绿原酸是一类极性较大的成分，而且是千里光膏饮片中的主要成分，但是浸膏中极性相对绿原酸较小的成分较多，且含量少. 本课题组考察了样品提取液经SPE 柱纯化和未经过SPE 柱纯化两种处理方法，由两组试验结果得出，提取液经SPE 柱纯化处理后，图谱采集时间缩短至10 min，实现了对分析物绿原酸的富集，有效缩短了HPLC 的图谱采集时间，且重现性好，回收率高，故选择SPE 对提取液做纯化处理.

4 小结

本试验首次建立了测定藏药千里光膏饮片中绿原酸的TLC 法和HPLC 法，该方法快捷方便、准确可靠，为全面评估千里光膏饮片质量提供了一定的参考.试验中使用了SPE 柱对样品中绿原酸等极性相对较大成分进行富集处理，并进行了系统的方法学考察.该方法具有简便快捷、准确可靠、重复性、稳定性较好等特点.实验得出10 批千里光膏饮片产品中的绿原酸百分含量在1.59 % ～3.07 %之间，因此建议千里光膏饮片中的绿原酸含量不得低于1.0 %.