人源ADAM17基因干扰表达载体的构建与鉴定

张春利，蔡徐山，宦 宇，齐结华，王晓青，王东江

(上海市嘉定区妇幼保健院检验科，上海 201821)

去整合素金属蛋白酶17(ADAM17)是去整合素金属蛋白酶家族(ADAMs)的重要成员之一。ADAMs是近年来发现的一类具有金属蛋白酶活性的细胞膜表面糖蛋白，迄今为止已发现有40多个成员，这些成员大多含有金属蛋白酶结构域，它们参与了多种生物学功能，包括生育、黏附、迁移、炎症、蛋白水解、细胞传导以及肿瘤的发生发展等[1]，目前研究较多的是ADAM10、ADAM17。ADAM17的前体结构域能与锌催化位点相结合，只有当其前体结构域被蛋白酶水解后，ADAM17才具有酶催化活性，从而参与多种蛋白的水解[2]。ADAM17的一个重要功能是能剪切细胞膜上没有活性的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，并与相应受体结合，激活下游信号通路，参与一系列生物学过程，所以ADAM17又称为肿瘤坏死因子α转换酶(TACE)[3]。已有研究表明，ADAM17在多种肿瘤中表达水平明显升高，并在肿瘤的发生发展中发挥重要的促进作用，因此有必要对ADAM17进行深入的研究。

RNA干扰(RNAi)是一种由双链RNA所诱导的转录后基因表达沉默现象，通过RNAi途径，特异地降解其目的基因，从而抑制该目的基因的表达[4]。RNAi技术对靶基因的沉默具有高效、特异、设计简便、操作方便等特点。近年来在基因功能研究及相应的后续基因治疗中已有较广泛的应用。本研究旨在构建能够有效靶向人源ADAM17基因的shRNA表达质粒，从而为后续研究做准备。

1 材料与方法

1.1材料来源 人胰腺癌细胞株(PANC1)、感受态细胞stbl3、pLKO.1-puro载体由江苏大学医学院提供。高糖DMEM溶液购自Wisent公司；PBS溶液购自Hyclone公司；胰蛋白酶粉购自生兴公司；胎牛血清FBS购自Gibco公司；DMSO购自Sigma公司；转染试剂Lipofectamine 2000购自Promega公司；限制性内切酶EcoRⅠ和AgeⅠ购于NEB公司；逆转录试剂盒、预染蛋白质Marker、DNA相对分子质量Marker DL2000、DL15 000购自Thermo公司；2×Green PCR Mix、2×SYBR Green Mix购自TransGen公司；PVDF膜购自BIO-RAD公司；兔抗人ADAM17抗体购自Cell Signaling公司；鼠抗人GAPDH抗体购自Santa Cruz公司；羊抗兔、羊抗鼠二抗购于Santa Cruz公司；dsDNA oligos由生工(上海)股份有限公司合成；30%丙烯酰胺购于苏州圣康科技公司；T4连接酶购自takara；Trizol、柱式质粒DNA小量抽提试剂盒、柱式DNA胶回收试剂盒购于生工(上海)股份有限公司；DNA测序由生工(上海)股份有限公司完成。

1.2方法

1.2.1ADAM17干扰表达载体的构建 根据Sigma公司提供的ADAM17干扰序列5′-CCG GCC CAT GAA GAA CAC GTG TAA ACT CGA GTT TAC ACG TGT TCT TCA TGG GTT TTT G-3′，5′-AAT TCA AAA ACC CAT GAA GAA CAC GTG TAA ACT CGA GTT TAC ACG TGT TCT TCA TGG G-3′，以干扰与人的任何基因序列均无同源关系的eGFP为阴性对照，序列为5′- CCG GTA CAA CAG CCA CAA CGT CTA TCT CGA GAT AGA CGT TGT GGC TGT TGT ATT TTT-3′，5′-AAT TAA AAA TAC AAC AGC CAC AAC GTC TAT CTC GAG ATA GAC GTT GTG GCT GTT GTA-3′，送至生工(上海)股份有限公司合成。将ADAM17基因shRNA的正链、反链退火形成双链DNA。该DNA片段含有限制性内切酶AgeⅠ和EcoRⅠ所能识别的黏性末端；将该退火双链DNA与pLKO.1载体经AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切后胶回收的产物在T4连接酶的作用下进行连接，将连接好的产物转化到感受态细胞Stbl3中，并涂于含有氨苄青霉素的培养板上进行筛选培养。挑取单克隆菌落进行扩增，用菌液PCR鉴定，并提取质粒送往生工基因测序鉴定。

1.2.2转染PANC1细胞 将PANC1细胞培养至对数生长期，并接种到6孔板中。每孔加入约2 μL无抗生素培养基，培养细胞至融合度约为70%～80%时，参照Lipofectamine 2000说明书的方法将ADAM17 shRNA及阴性对照组eGFP shRNA分别转染至PANC1 细胞中，5～6 h后更换为完全培养基，继续培养。

1.2.3q-PCR检测重组载体干扰效果 将上述转染细胞培养48 h，Trizol法提取总RNA，逆转录得到cDNA，再根据TransGen qPCR(SYBR)试剂盒的说明书来扩增。ADAM17上游引物序列:5′-AGA GCT GAC CCA GAT CCC AT-3′，下游引物序列:5′-TAC TCT CTT CCC CTC TGC CC-3′。GAPDH上游引物序列:5′-TGG GGA AGG TGA AGG TCG G-3′，下游引物序列:5′-CTG GAA GAT GGT GAT GGG A-3′。以GAPDH为内参，以2-△△Ct法分别计算并比较干扰组和对照组ADAM17 mRNA的表达水平。

1.2.4Western blot检测重组载体干扰效果 收集转染48 h后的干扰组和对照组PANC1细胞，用细胞裂解液提取各组总蛋白，进行10% SDS-PAGE电泳，将蛋白转移至PVDF膜上后，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，再用抗人ADAM17的兔源抗体(1∶1 000，3% BSA) 4 ℃孵育过夜，以β-tubulin为内参。次日，TBST洗膜5 min，并重复3次，加入HRP(辣根过氧化物酶)标记的山羊抗兔IgG(二抗，1∶5 000)，室温反应1 h；TBST洗膜后，用ECL试剂进行显影并检测。

1.2.5CCK-8法检测所构建质粒对PANC1细胞增殖能力的影响 将转染12 h后的各组细胞以1×103/孔的浓度接种于96孔板，并设置空白对照组(无细胞)，分别于24、48、72 h加入10 μL CCK-8溶液，避光孵育2 h后，用酶标仪490 nm波长测量各孔的吸光度。重复实验3次后取平均值，以时间为横坐标、吸光度为纵坐标绘制生长曲线。

2 结 果

2.1靶向ADAM17基因干扰表达载体的构建 菌液经PCR扩增后，所得产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，结果显示，产物1、3、4、5、6均有目的条带(图1)，将这5个菌液培养扩增并提取质粒后测序，测序结果完全正确(图2)。

注：M为DNA 2 000 bp marker;1 、2、3、4、5、6为不同菌落

图1菌液PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱

图2 重组质粒pLKO.1-puro ADAM17 shRNA的测序图谱

2.2荧光定量 PCR 检测 pLKO.1-puro ADAM17 shRNA干扰效果 为了明确 ADAM17 在转染后被干扰的效果，本研究用qPCR检测转染后不同组的mRNA 表达水平。如图 3 所示，与对照组相比较，转染ADAM17干扰载体的PANC1细胞，ADAM17 mRNA表达水平下调了65%以上，差异有统计学意义(P<0.05)。

注：*P<0.05，与sh-eGFP组比较

图3q-PCR评估shRNA干扰效果

2.3Western Blot检测 pLKO.1-puro ADAM17 shRNA干扰效果 Western Blot 检测结果显示(图4)，与对照组相比较，转染ADAM17干扰载体的PANC1细胞，ADAM17蛋白的表达水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，这说明所构建质粒对ADAM17蛋白的表达有明显的抑制作用，因此可用于后续实验。

2.4CCK-8实验检测pLKO.1-puro ADAM17 shRNA对PANC1细胞增殖的影响 为分析pLKO.1-puro ADAM17 shRNA对 PANC1细胞增殖速率的影响，分别在质粒转染后的24、48、72 h检测96孔板中各组细胞吸光度，分析其增殖情况。与对照组相比，干扰组细胞增殖速率明显降低(图5)，差异有统计学意义(P<0.05)。

注：*P<0.05,与sh-eGFP组比较

图4WesternBlot评估shRNA干扰效果

注：*P<0.05，与sh-eGFP组比较

图5pLKO.1-puroADAM17shRNA对PANC1

细胞增殖的影响

3 讨 论

去整合素-金属蛋白酶家族(ADAMs)是一类锌依赖性的跨膜糖蛋白，它们有5个基本功能：蛋白水解、生物活性因子释放、附着、融合和细胞内信号转导，因此，它们在生物发育和生存中的作用是复杂的、多方面的[5-6]。其中，ADAM17和肿瘤的关系已成为研究的热点，越来越多的研究表明，ADAM17在人类多种肿瘤中呈现高表达，而在正常细胞中表达很少，具有一定的肿瘤细胞特异度，并促进肿瘤转移、侵袭。Oh ST等通过免疫组化发现，ADAM17在皮肤鳞状细胞癌中的表达水平升高，且随分化程度越来越低，ADAM17的表达水平越来越高[7]；在肝癌中，ADAM17通过EGFR/PI3K/Akt通路介导了化疗抵抗[8]；CHEN等[9]的研究结果表明，miR-338-3p在胃癌中的表达水平降低，而过表达miR-338-3p后，胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力均被抑制，但ADAM17可以逆转miR-338-3p的这些作用，促进胃癌细胞增殖、迁移、侵袭；表皮生长因子受体(EGFR)是原癌基因c-erbB1编码的糖蛋白，属于Ⅰ型跨膜酪氨酸激酶生长因子受体，在许多人类实体肿瘤中有表达或过度表达，与肿瘤的形成和发展有关，而ADAM17可水解释放EGFR的多种配体[10-11]，HUANG等[12]的研究表明，ADAM17通过活化EGFR的多种配体，促进了头颈鳞状细胞癌的增殖、迁移；在肾癌细胞中，MicroRNA-145的降低使ADAM17表达水平升高，从而导致了肾癌的恶性进展[13]。综上所述，ADAM17在肿瘤的发生、发展中有一定的促进作用，有可能成为预测恶性肿瘤是否转移及预后的重要标志物。

RNAi是一种抑制基因表达的技术，通过小干扰RNA(siRNA)，降解同源mRNA，从而沉默特定基因表达[14-15]。其中，siRNA可通过体外转录或用化学方法合成，但化学合成siRNA成本较高、不能持续抑制基因表达、且易于污染，体外转录法得到的siRNA量有限，而shRNA可以解决这些问题，shRNA是在编码siRNA正、反链之间添加一段不互补的碱基序列，使RNA折叠成发卡结构形成loop环，与相应的载体连接构成质粒后，转染进入细胞，经胞质中的核酸酶切割成siRNA，siRNA解链后再与RNA诱导的沉默复合物(RISC)相结合，识别与其序列互补配对的同源mRNA，降解mRNA从而沉默目的基因[16]。该方法无需直接操作RNA，且作用效果更好，有更加广泛的应用前景。

本研究成功构建了人ADAM17基因干扰表达载体，在菌液PCR结果中，产物2没有目的条带，这可能是由于操作过程中不够严谨而出现杂菌污染，但其余5个产物均在相应位置有条带，且提取质粒后，测序结果完全正确。用该质粒转染人胰腺癌细胞PANC1，有效地下调了PANC1细胞中ADAM17 mRNA和蛋白水平的表达，同时，转染后细胞的增殖能力明显被抑制。

4 结 论

本研究将靶向ADAM17的shRNA连接到了pLKO.1-puro载体中，测序成功后，瞬时转染至胰腺癌细胞PANC1，显著降低了实验组细胞中ADAM17的mRNA和蛋白表达水平，说明该质粒构建成功；实验组细胞增殖速率显著降低，说明该质粒可在体外培养的肿瘤细胞中发挥作用，为进一步研究ADAM17在肿瘤发生、发展过程中的作用及机制奠定了基础。