36种中药对罗非鱼源无乳链球菌体外抑菌及生物被膜消除效果

丁 浩，董 靖，宋 怿，苏志俊，余琳雪，艾晓辉

(1.上海海洋大学，上海 201306；2.中国水产科学研究院长江水产研究所，武汉 430223；3.中国水产科学研究院，北京 100125；4.农业部水产品质量安全控制重点实验室，北京100125；5.湖北省水产品质量安全工程技术研究中心，武汉 430223)

近年来罗非鱼各种急性传染性疾病的流行呈上升趋势[1]，其中罗非鱼链球菌病是罗非鱼养殖中最为常见的一种疾病，该病给我国罗非鱼养殖业造成了巨大的经济损失。据报道，2009-2011年，罗非鱼链球菌病持续暴发，死亡率高达90%[2]，直接经济损失高达20亿元[3]。无乳链球菌具有广泛的宿主感染性，不但能引起鱼类链球菌病，还对哺乳动物、两栖动物具有致病性[4]。目前，抗生素是治疗水产动物细菌性疾病的主要手段之一，具有不可替代的作用。但由于在临床实践中由于抗菌药物的不合理使用导致了药物残留和耐药性产生等问题，对人类健康和水产品质量安全产生潜在的威胁[5]。而有研究表明，细菌生物被膜具有极强的抗药性及抗吞噬、抗趋化作用，有研究发现，生物被膜上细菌群体耐药性可以达到该细菌浮游状态的1 000倍[6]。因此应加强抗菌药物替代品的研发，逐步用无耐药性、无有害残留的替代品取代抗生素在水产养殖中的作用，以确保水产养殖业健康可持续发展。

现阶段，利用中草药防治鱼类疾病备受关注。国内外已有许多学者研究过中草药对人类和畜禽常见致病菌的抑菌效果，均证明了中草药具有不同程度的抑菌作用，而且中草药具有低毒、低残留、副作用小、不易诱导病原菌产生耐药性等特点[7,8]。目前已有不少关于中草药抑杀水产病原菌的报道，如：石榴皮和地榆能体外抑制海水养殖鲈鱼病原菌河弧菌(Vibruofluvialis)、鳗弧菌(V.anguillarum)、哈氏弧菌(V.harveyi)[9]；宁夏枸杞和黄芪在草鱼和吉富罗非鱼体内能抑制嗜水气单胞菌[10]。此外中草药成分复杂多样，既有抗菌成分, 又能提高自身抗病能力[11,12]，具有开发成绿色渔药的前景。本试验选取36种中药单体天然化合物，研究其对罗非鱼无乳链球菌体外抑菌试验和血根碱作用下细菌生长曲线的变化及抑制生物被膜形成揭示药物的抑菌过程及效果，为中草药防治罗非鱼无乳链球菌病害提供参考。

1 实验材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株

无乳链球菌(Streptococcusagalactiate)菌株333、319由中国科学院水生生物研究所李爱华研究员惠赠；菌株PBSA0903由海南大学郭伟良博士惠赠。

1.1.2 药物与试剂

中药单体天然化合物购自中国食品药品检定研究院(纯度HPLC>98%，批号：140521)；脑心浸液肉汤(BHI)购自青岛海博生物技术公司、水解酪蛋白(MH)购自杭州微生物试剂有限公司，结晶紫购自上海士锋生物科技有限公司。

1.1.3 试验仪器

生物安全柜购自新加坡ESCO；全自动化新型生化培养箱购自上海智成分析仪器制造有限公司、恒温摇床购自上海智成分析仪器制造有限公司；离心机购自大龙兴创实验仪器(北京)有限公司；牛津杯(内径6 mm，外径7.8 mm，高10 mm)购自上海化科实验器材有限公司；紫外分光光度计购自上海优尼科仪器有限公司；酶标仪购自美国BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 菌液的制备

将无乳链球菌接种于液体培养基中, 在30 ℃摇床中振荡(200 r/min)培养过夜, 吸取1 mL菌液于1.5 mL离心管中，10 000 r/min，离心1 min，舍去菌液上清，用无菌生理盐水稀释菌体至1.5×108CFU/mL(0.5麦氏比浊度单位)备用。

1.2.2 药液的配制

水溶性好的中药单体天然化合物以蒸馏水配制、水溶性不好的中药单体则用二甲基亚砜(DMSO)配制成储存液(40 960 μg/mL)；试验时用培养基稀释，DMSO终浓度<0.5%；抑菌试验中36种中药单体天然化合物浓度以水调试为1 mg/mL；采用牛津杯在每个MH琼脂平板打孔3个备用。

1.2.3 抗菌活性的测定

以灭菌棉拭子蘸取供试无乳链球菌的菌悬液分别均匀涂布接种于直径9 cm MH琼脂平板，待自然稍干后，向已打孔MH琼脂平板孔内滴加供试中药(浓度为1 mg/mL)，每孔30 μL，设置1 mg/mL DMSO对照组，置30 ℃培养箱培养24 h后观察并以游标卡尺测量抑菌圈直径的大小，以上实验重复3次，每孔取不同方向测2次，最终求6次测量的平均值[13]。

1.2.4 最小抑菌浓度(MIC)及最小杀菌浓度(MBC)的测定

利用微量稀释法药敏实验的方法测定36种中药单体天然化合物对受试菌株的最小抑菌浓度[14]。将配置好的中药和纯DMSO加入每孔载有100 μL BHI培养基96孔板中，每种药液均设置三组平行，DMSO在每孔中含量均小于1%。第11列和第12列加不含药的BHI培养液，其中第11列做为生长对照接种菌液，第12列做为空白对照不接种菌液。用BHI培养液将备用菌液浓度稀释至1.5×106CFU/mL的工作菌液，加入1至11列每孔100 μL，使第1孔至第10孔药物浓度为512、256、128、64、32、16、8、4 、2、1 μg/mL，第12列孔不加菌液，为空白对照空。放入恒温培养箱30℃培养24 h后肉眼观察，每个平行中无菌生长小孔对应的浓度即为最小抑菌浓度。

将筛选出的5种抑菌效果好的药物的MIC和高于MIC浓度的各个梯度的试管中的培养物0.1 mL，转接于BHI琼脂培养基平板，30°C培养24 h后观察有无菌落形成，无菌落形成的相应试管中的最低药物浓度即为该种药物对无乳链球菌的最小杀菌浓度(MBC)。

1.2.5 生长曲线的测定

选取抗菌效果较好的一种中药单体做生长曲线测定，将准备好的装有20 mL BHI培养基的15个50 mL锥形瓶灭菌，分成A、B、C三组备用。加入7.80、3.90、1.95、0.98 μL待试药品，设置16、8、4 、2 μg/mL及不加药空白对照组，然后再向每个锥形瓶中接入对应菌液0.1 mL(添加菌液之前吸取0.1 mL培养基弃去以消除加菌后总体积变化对试验影响)，适当振荡混匀。制成上述混合培养液后即进行第一次OD600nm值的测定，测定后将锥形瓶置于30 ℃恒温培养摇床中培养。之后每间隔1 h测定并记录OD600nm值一次，OD600nm值测定时以未接种细菌的BHI培养基作空白，每次测定时需在生物安全柜内进行取样，读取并记录数据。

1.2.6 生物被膜模型的建立及不同药物浓度作用下成膜的测定

细菌生物被膜的形成和测定参考文献[15]的方法并进行适当改进。具体步骤如下：在无菌96孔板中每孔加入BHI 培养液200 μL，再加入血根碱，使终浓度分别为32、16、8、4、2、1、0 μg/mL，再加入菌悬液10 μL(麦氏比浊度0.5)，以无菌BHI培养液作为阴性对照。将孔板放置于湿盒, 30 ℃孵育48 h， 每组做3个平行孔, 弃去96 孔板中的培养液，再向每孔中加入250 μL PBS，并吸弃，如此洗膜3次。将附着在96 孔板上的被膜用200 μL甲醇固定30 min。弃去固定液，待自然风干后，室温下用200 μL 0. 1% 的结晶紫对生物被膜染色30 min，弃去染色液，用PBS洗2次，干燥。将干燥的96 孔板中加入200 μL 33%乙酸溶液，置于摇床振摇30 min 以释放结晶紫染液。用酶标仪在630 nm波长测定吸光度。

2 结果与分析

2.1 对36种中药单体天然化合物的抗菌活性

由表1可见，三株无乳链球菌对不同中药单体天然化合物的敏感程度不同，相同浓度DMSO对受试细菌抑菌圈为0，其中333对15种中药单体抑菌圈>10 mm，PBSA0903对12种天然化合物抑菌圈>10 mm，319对13种中药单体抑菌圈>10 mm。经对比分析可知：三株无乳链球菌对血根碱、白屈菜红碱、和厚朴酚、厚朴酚、大黄酸抑菌圈>20 mm，对白藜芦醇、黄芩素表现为高敏，对柚皮素、二氢辣椒碱、黄连素、二氢杨梅素、丹皮酚、大黄酚、秦皮素、辣椒碱、山奈酚和金丝桃苷表现出不同的敏感程度，对其余中药单体抑菌圈<10 mm。

表1 36种中药单体对3株无乳链球菌细菌的体外抑菌作用

2.2 中药单体的MIC及MBC

36种中药单体对无乳链球菌的MIC测定结果显示，各种药物对三株链球菌抑菌效果表现一定程度的一致性，DMSO对照组MIC大于512 μg/mL，试验菌生长正常，其中血根碱、白屈菜红碱、和厚朴酚、大黄酸、厚朴酚5种中药单体对无乳链球菌最小抑菌浓度为8～32 μg/mL，抑菌活性最为明显；其次为二氢辣椒碱。二氢杨梅素、丹皮酚、大黄酚、山奈酚表现出较弱抑菌活性；其余中药单体对无乳链球菌无明显抑菌活性。详见表2。

表2 中药单体对三株无乳链球菌MIC

5种中药单体对3株细菌的MIC和MBC的测定结果见表 3。结果显示：血根碱对无乳链球菌333的抑杀效果最明显，MIC、MBC值均最小，分别为8 μg/mL和16 μg/mL，和厚朴酚与厚朴酚其次，MIC和MBC均为16 μg/mL，血根碱对无乳链球菌319和PBSA0903的MIC和MBC均为16 μg/mL，大黄酸、厚朴酚与和厚朴酚对其MIC、MBC均为16 μg/mL，效果优于其他四种药物，白屈菜红碱相对其他4种中药单体表现出较弱的抑杀效果。综合分析，血根碱对三株无乳链球菌的抑杀效果最好。

表3 有效药物对无乳链球菌的最小杀菌浓度(MBC)和最小抑菌浓度(MIC)

2.3 生长曲线

本试验选取对无乳链球菌抑杀效果最好的血根碱，并测定其对三株受试细菌生长趋势的影响。结果显示，加入不同浓度血根碱的受试细菌，从生长曲线可看出对数期和稳定期OD600 nm值均位小于对照组，且浓度越高，OD600 nm值越小。菌株333与319对数期起始时间随着药物浓度增大有所推迟，333空白对照组、2 μg/mL组和4 μg/mL组的对数期起始时间分别为2 、3 、4 h，319空白对照组的对数期起始时间分别为2 、3 、4.5 h。其中8 μg/mL、16μg/mL两组在其余三组达到对数期后依然停留在迟缓期，详见图1、2。PBSA0903生长周期长于其他两株受试细菌，且血根碱对其作用效果明显强于其他两株细菌，当血根碱浓度达到4 μg/mL时，其生长对数期延迟到第13 h，表明链球菌生长受到明显抑制，而且这种抑制效果表现在细菌生长周期的各个时期，详见图3。

图1 不同血根碱浓度下无乳链球菌333的生长曲线

图2 不同血根碱浓度下无乳链球菌319的生长曲线

图3 不同血根碱浓度下无乳链球菌PBSA0903的生长曲线

2.4 血根碱对生物被膜形成能力的影响

测定抑菌效果相对强的血根碱和抑菌效果相对弱的绿原酸对无乳链球菌333生物被膜生成率的影响。浓度为 32、16、8、4、2、1、0 μg /mL 血根碱和绿原酸作用无乳链球菌 333，以未加药物的阳性对照，显示血根碱浓度由高到低的作用下无乳链球菌生物被膜的生成率分别为0.59%、2.76%，60.21%、76.59%、96.69%、96.96%，绿原酸作用下受试细菌生物被膜生成率分别为94.03%～96.50% (图4)。结果显示：一定浓度的血根碱对无乳链球菌被膜有明显的抑制作用，以阳性组为参照，浓度为4 μg/mL 的血根碱开始极显著抑制无乳链球菌生物被膜的生成(P<0.01)，血根碱浓度超过16 μg/mL时无乳链球菌333成膜量急剧下降到2.76%以下，与8 μg/mL及以下浓度组差异极显著(P<0.01)，几乎不能形成生物被膜。而同样培养条件下，不同浓度绿原酸对受试菌株生物被膜生成率维持在较高水平，且不具显著差异，可见药物抑制细菌生长时同时也抑制生物被膜的生成。

图4 不同浓度血根碱和绿原酸下无乳球菌生物被膜的生成率(n=3)

3 讨论

本实验结果表明，36种中草药在实验条件相同的情况下抑菌效果存在较大差异，其中血根碱、白屈菜红碱、厚朴酚、和厚朴酚和大黄酸5种中草药单体对三株链球菌显示较强的抑菌效果，黄连素、二氢杨梅素、黄芩素表现出较弱抑菌活性；其余药物抑菌效果更弱，血根碱作为一种天然的植物源性抗菌生物碱，是植物博落回提取液中的主要成分，生物性能好，毒副作用小[16]，本试验中血根碱的抗菌活性(MIC、MBC分别为8 μg/mL、16 μg/mL)优于其他药物。对于血根碱的抗菌活性，Wink等[17]在研究生物碱的作用靶位的同时，还测定了包含血根碱在内的51种生物碱对大肠杆菌、沙门氏菌及枯草杆菌的最低抑菌浓度，结果表明血根碱对其达到100%杀灭率的浓度最低。白屈菜红碱与血根碱均为博落回树生物碱成分，对某些细菌、真菌和病毒有抑制活性[18]，两者在分子结构上只是个别基团不同，但在抑菌活性上存在差别，有研究表明，白屈菜红碱对金黄色葡萄球菌的抑制作用大于血根碱；然而作用在大肠杆菌和嗜水气单胞菌两种病原菌上时，血根碱的抑制作用强于白屈菜红碱，同时血根碱对巴氏杆菌有抑制作用，而白屈菜红碱未表现出抑菌作用[19]。有关通过抑制细菌生物被膜来抑制细菌活性已成为当今研究热点，陈俭清等[20]发现丁香叶、大黄和黄连水提物对生物被膜中的猪链球菌具有很好的杀灭作用，史祺云等[21]发现鱼腥草素钠对金黄色葡萄球菌浮游菌和早期生物被膜有较好抑制活性；而对于血根碱抑制细菌生物被膜研究，同样有研究表明血根碱在160 μg/mL下能通过生物被膜抑制大肠杆菌、沙门氏菌及金黄色葡萄球菌生长[22]。另外本试验中，抑菌实验与生长曲线实验就无乳链球菌PBSA0903的MIC结果存在差异，可能有两种试验方法中的细菌培养时间和培养基体积相关，可另设计试验做讨论。

细菌生物被膜是指细菌表层能使细菌之间相互粘附或使细菌粘附于固体的一种特殊的膜状结构[23]，其结构物质中含有藻酸盐多糖，能保护细菌免受物理或生化因子及机体免疫的干扰，生物被膜的存在对人类健康和食品安全存在很大的威胁。有研究发现生物被膜与细菌耐药性存在密切关系，能使细菌具有很强的耐药性和免疫逃逸性[24]。对于生物被膜抑制消除方式也有过不少报道，曹凤娇[25]对芦荟大黄素抑制金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)生物被膜形成试验中发现，芦荟大黄素通过抑制胞外蛋白和胞外多糖的产生从而抑制生物被膜形成。同样也有研究显示，血根碱的加入可抑制藻酸盐合成的某个基因，进而影响整个基因调控过程，减少了藻酸盐的含量，从而抑制细菌生物被膜的形成[22]。本试验在以上实验基础之上对无乳链球菌进行生物被膜构建，并测定不同浓度血根碱对无乳链球菌生物被膜成膜的影响，结果显示血根碱对其生物被膜具有明显干扰，而相同浓度的绿原酸对受试菌株生物被膜的生成率几乎无影响。

中药抑菌方式除了以单体形式，还可以和其他单体或者某些批准的抗生素并联使用以加强药效[26-27]。需要指出的是，部分中草药及其单体虽然具有明显的抑菌活性，但其抑菌机理目前尚未完全明了，个别中草药体内外抗菌效果并不一致[28]，对于药物对生物被膜的作用同样主要集中于体外研究，这就忽略了体内药物作用的诸多因素，因此需结合动物体内试验加以比较验证才可以评价。本试验仅对中草药单体的体外抗菌活性及生物被膜干扰进行了研究，若想进一步将中药成分开发成渔药，还需对中草药的有效成分及其作用机制在体内体外做更深入研究。