电针“百会”“涌泉”对4月龄APP/PS1双转基因小鼠海马LC3和Aβ影响的研究＊

裴亚妮，杨 光，张 磊，高誉珊，张淑静，冯思凝，周英奕，张学婷，薛卫国＊＊

(1.北京中医药大学针灸推拿学院 北京 100029；2.北京中医药大学中医学院 北京 100029)

1 前言

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种以认知功能障碍为特征的渐进性中枢神经系统退行性疾病，主要病理特征被认为是神经元外β淀粉样蛋白（β-Amyloid，Aβ）沉积形成的老年斑（senile plaques，SP）和神经细胞内的神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles，NFTs）。目前研究显示，自噬功能障碍与AD的病理进程息息相关[1]。自噬（autophagy）是真核细胞内异常蛋白和受损细胞器被降解的重要生物学过程，一般经历自噬启动、自噬体形成、自噬体与溶酶体融合、蛋白降解4个阶段，对维持细胞内稳态具有重要作用。而神经元这类有丝分裂细胞不能通过细胞分裂有效地稀释原本细胞中累积的有毒碎片和受损细胞器，因此这一作用在神经元中显得更为重要[2]。

AD脑内自噬功能紊乱涉及自噬体形成、微管运输、自噬体与溶酶体融合及降解等不同阶段，与AD的两大病理假说（Aβ级联学说和tau蛋白过磷酸化学说）、Aβ产生、清除及微管相关蛋白密切相关[1]。目前关于AD的治疗原则是早发现早治疗，因为一旦AD发展到产生认知功能损害的中后病理阶段，这种病理进程便很难再逆转。现有研究显示，自噬紊乱不仅是除了老年斑、神经原纤维缠结之外的AD的重要病理特征，更有可能发生于这些病理特征之前[3,4]。AD转基因鼠4-5月龄时，纹状体轴突肿胀成成簇葡萄样结构、皮质和海马开始出现散在的Aβ沉积[5,6]，而此时行为学仍尚未体现出认知功能损害，直到6月龄时才能检测出AD模型与正常小鼠之间的认知水平差异[7]，因此，4月龄时此模型小鼠仍处于AD发病早期病理阶段，即AD的病理前期阶段，在这个阶段进行干预，符合其早发现早治疗的原则，同时也符合中医所提倡的“治未病”。

在自噬体形成的过程中，自噬相关蛋白LC3从游离态的LC3Ⅰ转变为膜型的LC3Ⅱ。当哺乳动物细胞自噬增强时，细胞内LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化会明显增加，即LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值增大，因此LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值通常用来判断自噬是否被激活[8]。近年来，以APP转基因鼠为AD模型，多个针刺治疗AD的机制研究结果显示，针刺可以改善APP转基因鼠空间学习记忆能力，降低其脑内Aβ水平，并改善相关神经递质、神经元再生、炎性反应等[9,10]，也存在针刺对自噬状态产生影响的可能性[11,12]。本课题组选取4月龄APP/PS1双转基因小鼠作为动物模型，通过免疫组化、免疫荧光、WB的实验方法，对在此阶段的AD转基因小鼠海马内可能存在的自噬状态进行初步判断，并评估电针在AD的病理前期阶段的干预对其海马内LC3和Aβ可能产生的影响。

2 材料与方法

2.1 材料

动物 4月龄雄性APP/PS1双转基因小鼠作为动物模型，4月龄、雄性C57BL/6小鼠（野生型）作为正常对照。动物从南京大学模式动物研究所购入（SCXK(苏)2015-0001)，饲养于北京中医药大学动物中心，采用自然昼夜节律光照，自由进食及饮水。本实验经北京中医药大学实验动物伦理委员会批准。

试剂与仪器 无菌针灸针（中研太和，0.25 mm×13 mm）；韩式穴位神经刺激仪（北京华卫产业开发公司，HANs LH202H型）；LC3抗体（美国，Abcam，ab48394）；免疫组化超敏试剂盒（迈新生物科技，KIT-9706）；DAB显色试剂盒（迈新生物科技，DAB-0031）；Aβ抗体（美国，CST，15126）；山羊抗小鼠荧光二抗（美国，Abcam，ab150115）；山羊抗兔荧光二抗（美国，Abcam，ab150077）；激光共聚焦显微镜（日本Olympus，FV1000-IX81）；山羊抗兔IgG抗体（中山金桥，ZB-5301）；ECL超敏发光液（Solarbio，PE0010）。

2.2 方法

2.2.1 分组与干预方法

16只4月龄、雄性APP/PS1双转基因小鼠随机分为2组：电针组（A）、模型组（M）；8只4月龄、雄性C57BL/6小鼠作为正常组（N）。

电针组：将小鼠以自制鼠袋固定于操作台上，按照小鼠针灸穴位图谱及比较解剖学方法，在顶骨正中取“百会”，在两足底前、中1/3交界处取“涌泉”。选用北京中研太和医药公司生产的一次性针灸针，规格0.25 mm×13 mm，穴位局部进行常规消毒，刺入2-3 mm，“百会穴”直接针刺，双“涌泉穴”接HANs电针仪，采用疏密波，频率为1/50 Hz，强度1 mA，以针柄震颤，动物保持安静不挣扎嘶叫为度，每次电针15 min，隔日1次。模型组和正常组：以与针刺组相同的方法束缚，每次15 min，隔日1次，共持续6周。

2.2.2 检测指标与方法

（1）脑组织取材

以10%水合氯醛腹腔注射深麻醉小鼠，断头，在冰盒上取脑，左半脑放入4%多聚甲醛固定，每组取4块用于免疫组化检测、4块用于免疫荧光检测；右半脑剥离小鼠的海马及脑皮质，放入EP管后，迅速保存于液氮中，用于WB检测。

（2）免疫组化法

每组取4块4%多聚甲醛固定后的脑组织，石蜡包埋，从视交叉处沿冠状轴切片，厚度为6 μm。染色步骤：脱蜡（二甲苯15 min/次，共3次；100%无水乙醇5 min/次，共2次；梯度乙醇依次浸泡5 min）；枸橼酸盐缓冲液热修复10 min；待恢复至室温后，PBS洗3次，每次5 min；过氧化物酶阻断剂（迈新生物科技，KIT-9706，A液）室温孵育10 min；PBS洗3次；山羊血清封闭液（迈新生物科技，KIT-9706，B液）室温封闭10 min；甩掉封闭液，加LC3抗体，4℃过夜；次日，PBS洗3次，加二抗（迈新生物科技，KIT-9706，C液），室温孵育10 min，PBS洗三次，加D液（迈新生物科技，KIT-9706，D液）；PBS洗3次，加DAB显色2 min；自来水冲洗，苏木素复染30 s；自来水冲洗，脱水（70%到100%梯度乙醇浸泡各5 min；100%二甲苯2次各10 min）；中性树胶封片。使用DXM1200相机，用Leica系统连接并采集图像。每只小鼠取1张免疫组化染色后的切片，在400倍放大下，分别取小鼠皮质和海马内的相同视野进行拍照。

图1 小鼠海马CA1区和皮质LC3表达情况（免疫组化×400）

（3）免疫荧光双标法

每组取4块固定后的脑组织，梯度蔗糖脱水，OCT包埋，从视交叉沿冠状轴切片，厚度为6 μm，切片置于-20℃保存。染色步骤：从-20℃取出切片，复温15 min，PBS洗3次，每次5 min；枸橼酸盐缓冲液热修复10 min；待恢复至室温后，PBS洗3次，每次5 min；山羊血清封闭液室温封闭10 min；甩掉封闭液，加一抗（滴加同体积的LC3抗体和Aβ抗体，混匀），4℃过夜；次日，PBS洗三次，加二抗（滴加同体积的抗兔二抗和抗鼠二抗，混匀），室温孵育1.5 h；PBS洗三次，DAPI封片。每只小鼠取1张免疫荧光染色后的切片，在激光共聚焦显微镜下放大600倍，取小鼠海马内的相同视野拍照。

（4）WB法

每组取8块小鼠右侧海马，按比例1∶100加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，匀浆后离心（4℃，10 min，10000 rpm）；离心后取上清液，BCA法蛋白定量试剂盒对上清液进行总蛋白定量，按照浓度80 μg·20 μL-1进行配平；采用10%分离胶和4%浓缩胶进行SDS-PAGE电泳；转膜后以5%脱脂奶粉室温封闭1 h；加入一抗（LC3，1∶1000，β-acting，1∶1000），4℃孵育过夜；加入二抗（1∶2000），室温孵育1 h；加入HRP-ECL发光液，全自动曝光机曝光，并采集图像；使用Gel-Pro_analyzer软件分析灰度值，然后对各组进行相对表达量比较。

2.3 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行统计分析。WB结果数据用均数±标准差(X¯±S)表示。各组数据均服从正态分布，方差齐，采用单因素方差ANOVA分析法；两两比较采用LSD法。以P＜0.05为差异有统计学意义，以P＜0.01为差异有显著统计学意义。

3 结果

3.1 LC3在小鼠脑中的表达情况

LC3的阳性表达呈深黄色或棕色，从被标记的细胞形态来看，被标记的细胞主要是神经元，LC3主要存在于神经元的胞质和轴突中，细胞核复染呈现蓝色（图1）。由于本次实验使用的LC3抗体既能标记出LC3Ⅰ，也能标记出LC3Ⅱ，本次免疫组化实验无法区分LC3Ⅰ和LC3Ⅱ，因此，本次免疫组化法着重于观察LC3的表达位置。在各组小鼠海马CA1区内，LC3主要表达于神经元胞质和轴突中，各组之间没有呈现出明显差异。但正常组与模型组、电针组比较，其海马内LC3标记的神经元轴突更连续、规整。在小鼠皮质中，从LC3所标记出的细胞形态来看，仍然主要是神经元，LC3仍主要存在于核周（胞质）以及轴突中（图1）。

3.2 LC3和Aβ在小鼠海马内的共表达情况

图2为LC3和Aβ在小鼠海马CA1区的共表达情况。LC3标记为绿色荧光，主要表达在核周（胞质）与轴突中，这与免疫组化结果相一致（图1）。Aβ标记为红色荧光，正常组与模型组所标记出的红色荧光存在肉眼可见的区别。Aβ在模型组中有明显更多的表达，主要聚集在核周（胞质），并且与LC3存在共表达关系。细胞核标记为蓝色荧光。

图2 小鼠海马CA1区LC3和Aβ的共表达情况（免疫荧光×600）

图3 各组小鼠海马LC3Ⅰ、LC3Ⅱ表达情况

图4 各组小鼠海马LC3Ⅰ/LC3Ⅱ比值情况

表1 各组小鼠海马区LC3Ⅰ/LC3Ⅱ的比较（X¯±S）

3.3 小鼠海马内LC3的WB结果

正常组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值大于模型组，P＜0.01，差异有显著统计学意义；电针组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值大于模型组，P ＞ 0.05（P=0.19），差异无统计学意义；电针组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值小于正常组，P＜0.05，差异有统计学意义。

4 讨论

中医学注重“治未病”，提倡“未病先防，已病防变”。《素问·四气调神大论》如是说：“大病已成而后治之，犹譬渴而穿井，斗而铸锥，不亦晚乎”，这也是现代AD的治疗原则——“早发现早治疗”。因此，本研究选取老年斑出现之前的处于AD病理前期的4月龄APP/PS1双转基因小鼠作为研究对象。

“肾气亏虚，痰浊蒙窍”是AD的主要病机[13,14]。中医认为AD病位在脑，与肾密切相关；其病性属本虚标实，虚实夹杂。肾主髓，肾气亏虚则髓海气化不足，气虚则生浊，渐成痰瘀浊毒，蒙蔽脑窍。“百会”居头之巅顶，“督脉者…上额交巅上，入络脑”，针刺“百会”有醒脑升阳益髓之功；“涌泉”为肾之井穴，为肾经之根，针刺“涌泉”可疏通肾经，充养髓海，正如《甲乙经》云：“忽忽善忘，涌泉主之”。两穴合用，一上一下，一近一远，既可补肾益髓，又可行气活血、化痰祛浊、开窍醒神[13]。

AD早期，肾气亏虚气化不利而生浊，自噬活性随之降低，即自噬不足而导致异常蛋白Aβ在细胞内聚集，但机体此时仍能保持相对平衡状态；但随着病情发展，聚集的Aβ作为病理产物，进一步引发自噬流紊乱，自噬体及自噬溶酶体聚集反而促成神经元内Aβ水平暴涨，诱发级联反应，而处于低阈值的机体平衡状态被破坏，反过来使其本身存在的气滞、血瘀、痰阻等一系列病理状态进一步加重，自噬紊乱与之形成恶性循环，诱发AD的一系列临床表现[15]。而针刺治疗AD可能具有双向调节作用，对AD不同病理阶段的不同自噬状态均可能产生一定的良性调节作用。

1992年，Hardy和Higgins提出淀粉样蛋白级联假说（Amyloid cascade hypothesis）[16]，Aβ在脑实质中的沉积也一直被认为是最终导致阿尔茨海默病发病的关键。而APPswe/PS1dE9双转基因小鼠一直是国际公认的影响Aβ水平的有效评价模型[17]。近些年，关于阿尔茨海默病治疗的研究，不断有“坏”消息传来，尤其是两项重要的临床试验结果更加重了悲观情绪［18,19］，甚至怀疑阿尔茨海默病淀粉样蛋白级联假说的准确性，但以往这些治疗方案的关键均集中在考虑Aβ的数量，生成速度和可逆的Aβ沉积，这中间存在着极大的不确定性，这种不确定性源于患有AD的人类脑中的Aβ沉积量的评估的复杂性，这种复杂性又源于人类大脑的自然异质性。而以Aβ级联连学说作为研究基础，仍然是值得肯定的，Aβ在AD的病程进展中仍处于关键位置。针对Aβ的治疗目前研究显示，Aβ的治疗作用主要取决于Aβ的沉积与tau病理进程之间的关系，由于当Aβ在脑内沉积达到一定程度时，会产生足够的“综合压力”来启动、加速tau的病理进程，在此之后，Aβ的变化与AD的进展之间被认为不再存在任何直接相关性[20]。因此，任何减少Aβ水平的治疗干预只有在这之前才能产生治疗效用，而在这之后则会收效甚微，但这中间的具体时机却很难把握确定。

本次实验探索性的选用4月龄APP/PS1双转基因小鼠进行电针干预，本次实验的WB结果显示，模型组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值小于正常组，P＜0.05，差异具有统计学意义,说明在AD的病理前期阶段，AD转基因小鼠海马内的自噬可能处于抑制状态。通过电针干预，对AD转基因小鼠海马内的自噬功能是否存在促进作用，电针组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值与模型组比较差异无统计学意义，而电针组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的均值是略高于模型组的，也许电针能够促进AD模型小鼠海马内的自噬水平；但电针组与正常组的比较，其均值低于正常组，差异有统计学意义，说明电针组小鼠海马内自噬可能还是处于较低的水平，电针干预对AD转基因小鼠海马内的自噬水平的影响可能较弱。但是本次实验样本量较小，并综合各种实验因素，电针干预对AD转基因小鼠海马内的自噬功能是否存在促进作用还需要进一步实验去证实。

众多AD的相关研究发现，神经营养不良性突起及神经元胞体内存在的大量自噬体和自噬溶酶体是Aβ生成的主要场所[21-23]。本课题组的前期研究显示[24]，对4月龄AD转基因小鼠进行电针干预后，能够有效地降低AD小鼠海马内的Aβ水平，改善AD小鼠的空间学习记忆能力。本次实验的免疫荧光结果显示，在AD转基因小鼠海马内，LC3与Aβ存在共表达，因此推测电针降低AD小鼠脑内的Aβ水平可能通过激活此时AD转基因小鼠脑内的自噬功能来实现；LC3的变化只是对自噬体形成过程的评估，本次实验的WB结果显示出的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值，电针组略高于模型组，电针对AD小鼠海马内的自噬体的形成略有促进，虽然结果显示电针组与模型组之间的差异无统计学意义，但并不能因此否定电针干预对4月龄AD小鼠海马内的自噬水平存在促进作用。而Aβ与自噬、自噬与AD的发病机制以及电针干预的具体作用机制仍有待于进一步研究。