微小核糖核酸-34a调节高迁移率族蛋白B1对卵巢癌细胞增殖的影响

王艳红，段瑞丽

(1.郑州市妇幼保健院妇产科，河南 郑州 450012;2.中国人民解放军信息工程大学门诊部，河南 郑州 450002)

卵巢癌是女性妇科恶性肿瘤中最常见的死亡原因，也是女性死亡率最高的原因。由于缺乏对卵巢癌早期症状特异和敏感的监测指标，大多数患者发现时已被诊断为晚期卵巢癌，其5 a生存率通常为30%[1-2]。卵巢癌治疗的标准方案为手术和放、化疗联合方案。尽管近年来随着治疗手段的进步，卵巢癌患者的生存时间有所延长，但大多数卵巢癌患者却依旧容易复发[3]。因此，找到合适的能够早期检测出卵巢癌的指标可能是改善卵巢癌患者治疗效果的关键。

微小核糖核酸(micro ribonucleic acids，miRNAs)是一类内源性非编码单链小分子RNA，长度一般约为22个核苷酸，可通过调控mRNA在生物活动中发挥重要作用[4]。miR-34a是新近发现的一种重要的肿瘤相关miRNA，在多种肿瘤组织中低表达，与肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭、迁移等均有关[5-6]。通过靶向预测和文献查阅发现miR-34a可靶向结合高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1，HMGB1)的3’-非翻译区(untranslated region，UTR)。HMGB1是一种高度保守的脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)连接蛋白，在卵巢癌及其他多种恶性肿瘤组织中高表达，其高表达与恶性肿瘤的凋亡、炎症、侵袭、转移密切相关[7-10]。有研究[11]发现，在视网膜母细胞瘤中miR-34a可以通过靶向抑制HMGB1的表达影响细胞的功能，但miR-34a是否可以通过调控HMGB1的表达影响卵巢癌SKOV-3细胞的增殖功能还尚待研究。本研究以SKOV-3细胞作为研究对象，探讨miR-34a是否可以通过抑制HMGB1的表达促进SKOV-3细胞增殖功能，从而为深入研究卵巢癌的发病机制提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 细胞株和主要试剂卵巢癌细胞株SKOV-3购自中国科学院上海生命研究所；RPMI-1640培养基购自北京索莱宝公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；转染试剂Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；qRT-PCR试剂盒和SYBR Green荧光染料试剂盒购自日本Toyobo公司，兔抗人HMGB1单克隆抗体和兔抗人β-actin单克隆抗体购自美国Abcam公司；细胞增殖毒性检测试剂盒(CCK-8)购自日本同仁研究所；空白对照、miR-34a模拟物对照、miR-34a模拟物、miR-34a抑制剂对照、miR-34a抑制剂均由广州锐博生物公司合成。

1.2 细胞培养SKOV-3细胞培养于RPMI-1640完全培养基(含有体积分数10%胎牛血清)中，并置于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养，待细胞融合度达到约80%时进行传代，或用于后续实验。

1.3 细胞转染实验将对数期生长的SKOV-3细胞接种到6孔板中，每孔2.5×105个细胞。当细胞融合度达到约80%时进行转染实验。转染实验严格按照Lipofectamine 2000试剂说明书进行，根据转染的目的基因进行分组：空白对照组、miR-34a模拟物对照组、miR-34a模拟物组、miR-34a抑制剂对照组、miR-34a抑制剂组。

1.4 CCK8法将对数生长期的SKOV-3细胞按6×103个/孔接种到96孔板中，分别于转染24 h、48 h和72 h后在每孔中加入10 μL的CCK8溶液，置于培养箱中孵育1～4 h，使用酶标仪测定490 nm处的光密度(OD)值，并计算细胞增殖率。细胞增殖率(%)=(实验组OD值/对照组OD值)×100%。每组设6个平行复孔。

1.5 qRT-PCR法按照Trizol法提取转染24 h后各组细胞的总RNA，并严格按照逆转录试剂盒进行逆转录，按照SYBR Green荧光染料试剂盒进行扩增。引物序列为(5’-3’)：miR-34a-F： ATTGCGGTGGCAGTGTCTTAGCT，miR-34a-R： ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG，HMGB1-F：ACAAGGCCCGTTATGAAAGA，HMGB1-R： GAAGAGGAAGAAGGCCGAAG。miR-34a和HMGB1的内参分别采用U6和β-actin，实验结果以2-△△Ct法计算目的基因的相对表达量。

1.6 Western blot法按照RIPA蛋白裂解缓冲液使用说明提取各组总蛋白，并用二喹啉甲酸(BCA)定量法测定蛋白的浓度。每孔取20 μg总蛋白进行电泳；用湿转法将蛋白转移到硝酸纤维素(nitrocellulose filter membrane，NC)膜上；体积分数5%脱脂牛奶封闭2 h，然后分别加入稀释好的HMGB1和β-actin单克隆抗体，4 ℃孵育过夜；最后加入二抗孵育2 h。用高敏感性化学发光显色并分析条带，条带以灰度值表示，采用Image J软件进行分析。HMGB1的相对表达量以HMGB1与β-actin的灰度值比值表示。

2 结果

2.1 SKOV-3细胞miR-34a的转染效率qRT-PCR结果显示，miR-34a模拟物组(3.57±0.31)的miR-34a相对表达量明显高于miR-34a模拟物对照组(1.17±0.24，P<0.05)，miR-34a抑制剂组(0.32±0.03)的miR-34a相对表达量明显低于miR-34a抑制剂对照组(1.08±0.13，P<0.05)，提示可进行下一步实验。

2.2 MiR-34a对SKOV-3细胞增殖的影响CCK8结果显示，作用24 h、48 h、72 h后，miR-34a模拟物组与空白对照组和miR-34a模拟物对照组比较，SKOV-3细胞的增殖率显著降低(P均<0.05)，miR-34a模拟物对照组与空白对照组细胞增殖率比较差异无统计学意义(P>0.05)。作用24 h、48 h、72 h后，miR-34a抑制剂组与空白对照组和miR-34a抑制剂对照组比较，SKOV-3细胞的增殖率显著升高(P均<0.05)，miR-34a抑制剂组与空白对照组细胞增殖率比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

图1 MiR-34a对SKOV-3细胞增殖的影响

2.3 MiR-34a对SKOV-3细胞HMGB1 mRNA和蛋白的影响与空白对照组(1.00，0.89±0.07)和miR-34a模拟物对照组(0.91±0.05，0.81±0.06)比较，miR-34a模拟物组(0.40±0.11，0.36±0.03)HMGB1 mRNA和蛋白的表达水平均明显降低(P均<0.05)。与空白对照组(1.00，0.81±0.09)和miR-34a抑制剂对照组(1.07±0.08，0.61±0.08)比较，miR-34a抑制剂组(1.63±0.10，1.76±0.07)中HMGB1 mRNA和蛋白的表达水平均显著升高(P均<0.05)。见图2、3。

图2 MiR-34a对SKOV-3细胞中HMGB1 mRNA的影响

图3 MiR-34a对SKOV-3细胞中HMGB1蛋白的影响

3 讨论

卵巢癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，随着国家工农业的发展所导致的环境污染加重和人类寿命的延长，卵巢癌的发病率呈逐年上升的趋势。在临床上，卵巢癌首选手术切除治疗，并辅助放疗和化疗等综合治疗。由于卵巢癌发现时已处于晚期，术后的复发率仍然很高，且恶性程度也会提高。因此，现在临床急需能早期发现卵巢癌的检测方法和有较好治疗效果的治疗方法。

MiRNAs的异常表达与人类的多种疾病密切相关，包括恶性肿瘤、炎症和心血管疾病等[12-14]。miR-34a是肿瘤抑制基因，其在神经母细胞瘤、膀胱癌和子宫内膜癌等疾病中发挥作用[11,15]。 虽然林兰等[5]研究发现，miRNA-34a可以通过抑制其靶基因AXL影响卵巢癌SKOV-3细胞的多种生物学过程，但miR-34a对卵巢癌发病机制的具体影响仍需要进一步研究。本研究发现，过表达miR-34a可抑制SKOV-3细胞增殖，抑制miR-34a可促进SKOV-3细胞增殖。MiRNAs往往通过调控其下游基因发挥作用，本研究通过靶基因预测网站发现HMGB1是miR-34a的靶基因之一，并且已在神经母细胞瘤中得到了验证[11]。HMGB1是一种重要的核蛋白，其主要功能是稳定染色质结构和功能，并调控基因转录[16]。目前，HMGB1在肿瘤治疗中的作用越来越重要，其能够调控肿瘤免疫功能并影响放、化疗效果，进而最终影响肿瘤的发生、发展[17-19]。但是，miRNA-34a是否通过调节HMGB1的表达来抑制SKOV-3细胞增殖功能，尚未见文献报道。本研究还发现，miR-34a可抑制HMGB1 mRNA及其蛋白在SKOV-3细胞中的表达。因此，miR-34a可能通过靶向抑制HMGB1的表达来影响SKOV-3细胞的增殖能力。

综上所述，本研究从细胞水平阐明miR-34a和HMGB1可能参与了卵巢癌的发病，分子机制是miR-34a可能通过靶向抑制HMGB1的表达抑制卵巢癌细胞的增殖，影响卵巢癌细胞的生物学特性，进而促进卵巢癌的发生、发展，这也为临床卵巢癌的治疗提供了一个可行的研究思路。