黄连解毒汤含药血清对Aβ25-35诱导HT22细胞损伤的影响

张茹兰，黄启辉∗，黄秀芳，李建军，陶彦谷

（1.中山大学孙逸仙纪念医院，广东 广州 510300；2.广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510080）

阿尔茨海默病是以记忆丧失、认知障碍为临床表现的神经退行性疾病，主要病理特征之一是细胞外Aβ 沉积形成老年斑，导致广泛海马神经元缺失［1］，β 淀粉样蛋白25-35（Aβ25-35）是 Aβ 毒性片段之一，对体外培养、在体神经细胞均具有毒性作用［2］，在发病过程中神经元损伤与氧化应激和线粒体凋亡途径密切相关［3］。阿尔茨海默病属中医“痴呆”范畴，王永炎院士 “毒损脑络”理论认为，脑为 “清灵之府”，受秽气浊毒侵袭，体内痰浊、瘀血等化热成毒，导致脑窍壅塞、神机失用而发为痴呆［4］。

黄连解毒汤由黄连、黄芩、黄柏、栀子组成，功效清热解毒。为了探究该方含药血清的神经保护作用，阐明其治疗阿尔茨海默病的作用机制，本实验采用Aβ25-35建立细胞模型，观察它对HT22 细胞（是小鼠海马神经元细胞系，分化后的HT22 细胞是具有功能性的胆碱能神经元，是能够很好地进行认知功能障碍研究的体外模型［5］）存活率，氧化应激关键指标超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA），线粒体凋亡关键指标 Bcl-2、Bax、Cyt C、Caspase-3 的影响，初步探讨其神经保护作用及机制，为相关临床应用提供依据。

1 材料

1.1 动物 3月龄 SPF 级雄性 SD 大鼠 40 只，体质量（200±20）g，购自中山大学实验动物中心，清洁级饲养，实验动物许可证号 SCXK（粤）2004-0011，本实验经中山大学实验动物伦理委员会批准。

1.2 药物 黄连解毒汤由黄连9 g、黄芩 6 g、黄柏 6 g、栀子9 g 组成，由中山大学孙逸仙纪念医院中药制剂中心提供（批号分别为 20110802、20110413、20110616、20110919）。按处方量称取药材，蒸馏水煎煮，水煎液浓缩至1 ∶2 时停止，待药液放冷后，边搅拌边缓慢加入乙醇使含醇量达50%，静置48 h 后滤取上清液，回收乙醇，蒸馏水配制成生药量为6.48 g／mL，临用前加蒸馏水分别稀释成 0.27、0.81 g／mL 溶液。盐酸多奈哌齐（5 mg／片，卫材中国药业有限公司，批号100801053），临用前加蒸馏水稀释成 0.09 mg／mL溶液（它为乙酰胆碱酯酶抑制剂，具有神经保护作用［6］，为临床治疗阿尔茨海默病常用药物，故选择其作为阳性对照）。

1.3 试剂 Aβ25-35、DMSO（美国 Sigma 公司）；DMEM 培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶（美国Gibco 公司）；PBS 缓冲液（北京索莱宝科技有限公司）；SOD、GSH-Px、MDA 试剂盒（南京建成生物工程研究所）；β-action，Bax，Bcl-2，Cyt C、Caspase-3 抗体（美国Proteintech 公司）。

1.4 仪器 Galaxy 170S CO2细胞培养箱（德国Eppenddorf 公司）；Reader M3 多功能酶标仪（美国 Molecular Devices 公司）；HWS-12 电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）；SW-CJ-1F 超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）。

2 方法

2.1 Aβ25-35溶液制备 Aβ25-35溶于去离子水中，0.22 μm 微孔滤膜过滤，37 ℃下于孵化器中孵育7 d 后，-20 ℃ 下避光保存。文献［7］报道，40 μmol／L Aβ25-35作用于分化及未分化的 HT22 细胞24 h 时约为半抑制浓度，故可建立较理想的阿尔茨海默病细胞模型。

2.2 含药血清制备 40 只大鼠随机分为空白组、模型组、多奈哌齐组及黄连解毒汤低、高剂量组，每组8 只，用药剂量按动物体表面积比率换算等剂量法，黄连解毒汤低、高剂量组大鼠分别以成人等效剂量的 1、3 倍灌胃给药，即 2.7、8.1 g／kg，多奈哌齐组大鼠灌胃给予0.09 mg／mL 药物，空白组、模型组大鼠灌胃给予蒸馏水，各组大鼠每次灌胃 2 mL，1 次／d，连续 7 d。最后 1 次给药 3 h 后，大鼠腹主动脉穿刺取血，离心，取上清，除菌，灭活，-20 ℃下保存备用。

2.3 细胞培养 HT22 细胞由中山大学孙逸仙纪念医院神经内科刘军教授惠赠，培养于中山大学孙逸仙纪念医院实验室，在37 ℃、5%CO2条件下于含10%FBS 的 DMEM 培养基中培养，每 2 d 更换 1 次培养基。将细胞随机分为空白组、模型组，多奈哌齐组及黄连解毒汤低、高剂量组，其中空白组、模型组大鼠给予含10% 空白血清的DMEM 培养基，多奈哌齐组给予含10%药物血清的DMEM 培养液，黄连解毒汤低、高剂量组大鼠分别给予含10% 药物低、高剂量血清培养基。培养1 h 后，空白组加无血清DMEM 培养液，其他各组加 Aβ25-35使其终浓度为 40 μmol／L，孵育 24 h。

2.4 细胞活性检测 采用MTT 法。取HT22 细胞，以 2.5×103／孔密度接种于 96 孔板中（100 μL／孔），分组同上，接种 12 h 后给予含药血清、Aβ25-35处理，24 h 后各组均加入 20 μLMTT（5 mg／mL，溶于 0.01 mol／L PBS 缓冲液中），继续培养4 h后测定各孔光密度（OD 值），检测波长为570 nm。

2.5 SOD、GSH-Px 活性及 MDA 水平检测 采用比色法。取 HT22 细胞，以 5×103／孔密度接种于96 孔板中培育 12 h，每孔体积 100 μL，分组同上，12 孔／组，含药血清、Aβ25-35处理 24 h 后，取各组细胞上清液，4 ℃、1 500 r／min 下离心 10 min，严格按照试剂盒说明书检测。

2.6 Bax、Bcl-2、Cyt C、Caspase-3 蛋白表达检测 采用Western blot 法。HT22 细胞于6 孔板中培养 12 h，密度为 1×105／孔，含药血清、Aβ25-35处理后，按照文献［8］方法提取蛋白，进行12% SDSPAGE 凝胶电泳，浓缩胶 90 V，分离胶 120 V；电转至 PVDF 膜上，5% 脱脂奶粉室温下封闭 1 h，TBST（含 10 mmol／L Tris-HCl、150 mmol／L NaCl、0.5% Tween-20，pH 7.5）洗涤 3 次，每次 5 min，加抗体Bax、Bcl-2、Cyt C、Caspase-3（1 ∶2 000）、β-actin（1 ∶2 000），4 ℃ 冰箱中过夜；TBST 洗膜3 次，每次 5 min；加兔二抗（1 ∶2 000），室温下反应 2 h；TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；滴加 ECL发光液，GE 凝胶成像系统测量各目的条带灰度值，计算其与内参β-actin 蛋白灰度值之比。

2.7 统计学分析 通过SPSS 22.0 软件进行处理，数据以（）表示，各组比较采用单因素方差分析，组间差异多重比较采用SNK 法，检验水平α=0.05。P＜0.05 差异有统计学意义。

3 结果

3.1 黄连解毒汤对HT22 细胞活性的影响 表1、图1显示，与空白组比较，模型组HT22 细胞活性显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，黄连解毒汤组其活性显著升高（P＜0.05，P＜0.01），以高剂量组更明显（P＜0.01）。

表1 黄连解毒汤对HT22 细胞活性的影响（， n=12）Tab.1 Effect of Huanglian Jiedu Decoction on HT22 cell viability（， n=12）

表1 黄连解毒汤对HT22 细胞活性的影响（， n=12）Tab.1 Effect of Huanglian Jiedu Decoction on HT22 cell viability（， n=12）

注：与空白组比较，∗∗P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与黄连解毒汤低剂量组比较，▲▲P＜0.01

组别 剂量／（g·kg-1）存活率／%空白组 — 100.00±0.15模型组 — 45.51±3.87∗∗多奈哌齐组 0.000 9 65.56±2.51△△黄连解毒汤低剂量组 2.7 49.36±3.95△黄连解毒汤高剂量组 8.1 67.53±4.62△△▲▲

图1 黄连解毒汤对HT22 细胞活性的影响Fig.1 Effect of Huanglian Jiedu Decoction on HT22 cell viability

3.2 黄连解毒汤对 SOD、GSH-Px 活性及 MDA 水平的影响 表2显示，与空白组相较，模型组SOD、GSH-Px 活性显著降低（P＜0.01），MDA 水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，黄连解毒汤组 SOD、GSH-Px 活性显著升高（P＜0.01），MDA 水平显著降低（P＜0.01），以高剂量组更明显（P＜0.05，P＜0.01）。

3.3 黄连解毒汤对 Cyt C、Bcl-2、Bax、Caspase-3 蛋白表达的影响 图2～3显示，与空白组比较，模型组Cyt C、Caspase-3 蛋白表达显著升高（P＜0.01），Bcl-2／Bax显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，黄连解毒汤组 Cyt C、Caspase-3 蛋白表达显著降低（P＜0.05，P＜0.01），Bcl-2／Bax显著升高（P＜0.05，P＜0.01），以高剂量组更明显（P＜0.05）。

表2 黄连解毒汤对SOD、GSH-Px 活性及MDA 水平的影响（， n=12）Tab.2 Effects of Huanglian Jiedu Decoction on SOD，GSH-Px activities and MDA level（， n=12）

表2 黄连解毒汤对SOD、GSH-Px 活性及MDA 水平的影响（， n=12）Tab.2 Effects of Huanglian Jiedu Decoction on SOD，GSH-Px activities and MDA level（， n=12）

注：与空白组比较，∗∗P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01；与黄连解毒汤低剂量组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

组别 剂量／（g·kg-1）SOD／（U·mL-1）GSH-Px／（U·mL-1）MDA／（nmol·mL-1）空白组 — 163.56±65.34 563.64±64.34 14.43±2.54模型组 — 88.32±55.64∗∗ 332.64±97.24∗∗ 35.32±3.43∗∗多奈哌齐组 0.000 9 128.65±32.34△△ 502.76±75.28△△ 18.54±4.75△△黄连解毒汤低剂量组 2.7 103.64±65.65 355.96±54.43 27.54±3.64△△黄连解毒汤高剂量组 8.1 135.65±54.49△△▲ 512.64±33.96△△▲▲ 19.64±2.75△△▲▲

图2 各组 Cyt C、Bcl-2、Bax、Caspase-3 蛋白表达Fig.2 Cyt C，Bcl-2，Bax and Caspase-3 protein expressions in various groups

4 讨论

在阿尔茨海默病的发生与进展中，神经元细胞凋亡参与其中［9-10］。Aβ 可通过改变凋亡相关基因Bcl-2 家族的表达来诱导细胞凋亡［11］，激活存活信号通路是保护 Aβ 诱导的的神经元凋亡途径［12］。Bcl-2 家族成员中的Bcl-2、Bax 是线粒体膜渗透性的主要调节因子，前者是一种抗凋亡蛋白，可维持线粒体膜通透性，从而稳定线粒体完整性，减少细胞色素 C 释放，抑制细胞凋亡［13］；后者是一种促凋亡蛋白，可影响线粒体膜渗透性，诱导细胞色素C 从线粒体膜间隙进入胞浆释放，从而引起细胞凋亡［14-15］。另外，细胞色素 C 可通过激活 Caspase-9进而激活 Caspase-3，最终导致细胞凋亡［16-17］。

氧化应激是由于机体活性氧产生、抗氧化失衡所致，自由基生成过多或机体清除能力受限时，可引起脂质过氧化，使得神经元细胞受损。SOD 是一种抗氧化酶，可通过清除超氧阴离子来保护组织免受损伤，间接反映了组织抗氧化能力；GSH-Px是一种催化过氧化氢分解的酶，可通过催化还原型谷胱甘肽对过氧化氢的还原反应，起到保护细胞膜结构、功能完整的作用；MDA 是一种脂质过氧化产物，可反映组织氧化程度，故三者可间接反应机体受自由基攻击的严重程度及清除自由基的能力［18］。同时，氧化应激可作为各种形式的细胞死亡中一种常见的最终途径，Aβ 引起阿尔茨海默病也与其有关，氧化应激产物对患者具有毒性作用，可通过激发氧自由基的产生，脂质过氧化，损伤神经元细胞，诱导凋亡相关基因的表达，最终激活Caspase，使神经元细胞大量凋亡流失［19］，并诱发该疾病。

图3 黄连解毒汤对 Cyt C（A）、Bcl-2／Bax（B）、Caspase-3（C）蛋白表达的影响Fig.3 Effects of Huanglian Jiedu Decoction on Cyt C（A ），Bcl-2／Bax（B ）and Caspase-3（C ）protein expressions

黄连解毒汤为清热解毒的代表方剂，源于唐代王焘 《外台秘要》，基于 “痰、瘀、火”为阿尔茨海默病的病机基础，由清热解毒药材黄连、黄芩、黄柏、栀子组成。方青等［20］报道，黄连解毒汤可能通过干预Aβ 沉积对神经细胞的作用来显著改善阿尔茨海默病动物模型的记忆障碍和学习能力；陈国华等［21］发现，黄连解毒汤可减少 APP ／PS1 双转基因AD 模型小鼠海马CA1 区SP 数量和胞外诱捕网（NETs）形成，并降低 IL-6、IL-1β 水平，表明该方能保护神经细胞，减少老年斑生成，从而起到防治作用；柴山周乃等［22］临床研究显示，黄连解毒汤可增加阿尔茨海默病患者脑部血流量，对其认知功能有明显的改善作用；付晓春等［23］指出，黄连解毒汤可抑制大鼠局灶性脑缺血再灌注后神经细胞凋亡，其作用机制是通过下调Caspase-3 表达来实现；龙建飞等［24］研究表明黄连解毒汤水提物可通过抑制 Caspase-3 活性，降低 PARP 过度表达，从而降低大鼠缺血半暗带皮层NeuN 阳性细胞凋亡，保护缺血半暗带神经元。

课题组前期发现，黄连解毒汤含药血清可改善氧化应激对神经的毒性作用，从而改善SAM-P／8小鼠学习记忆能力［25］，为了进一步探究其神经保护作用，本实验采用Aβ25-35建立阿尔茨海默病细胞模型，观察其对Aβ25-35诱导HT22 细胞活性的影响。结果，Aβ25-35（40 μmol／L，24 h）诱导 HT22细胞阿尔茨海默病模型时，细胞活性明显下降，提示造模成功；细胞上清液中SOD、GSH-Px 活性明显降低，MDA 活性明显升高，提示出现氧化应激；Bcl-2／Bax 比值明显降低，Cyt C、Caspase-3 蛋白表达明显升高，提示线粒体凋亡途径被激活，而黄连解毒汤含药血清可减轻Aβ25-35诱导的HT22 细胞氧化应激反应，逆转 Bcl-2／Bax，抑制细胞色素 C 释放，同时下调Caspase-3 蛋白表达，从而抑制细胞凋亡，对细胞神经毒性起到保护作用。因此，黄连解毒汤可能成为预防或治疗阿尔茨海默病的潜在药物，但由于该方所含药材成分复杂，作用环节多，故对其作用机制的研究还需进一步深入。