刺柏属6种植物枝叶和果实中挥发性成分分析

张 姣德 吉朱孟夏卢 燕∗付爱玲∗陈道峰

（1.西南大学药学院，重庆 400715；2.复旦大学药学院，上海 201203；3.西藏大学理学院，西藏 拉萨 850000）

柏科刺柏属多种植物的枝叶和果实具有清热、祛风除湿等功效［1-3］，在藏药中又称徐巴，收载于 《晶珠本草》，其香味独特，在藏族人民生活中还被视为重要的熏香植物，用作焚香、驱虫［4］。徐巴为著名藏药浴五味甘露汤的组成成分之一，用于治疗类风湿关节炎、慢性腰腿疼等疾病［5］，也在其他藏药方剂中使用，如十味诃子丸、十四味羚牛角丸、二十味槟榔丸等，其基源复杂，常见的有香柏、大果圆柏、密枝圆柏、滇藏方柏枝、高山柏、垂枝香柏等10 多种。刺柏属植物枝叶中富含挥发油（0.28～1.5%）［6-10］，主要为单萜烯、含氧倍半萜等类成分，并显示出丰富的生物活性，如高山柏、方枝柏、滇藏方枝柏、大果圆柏挥发油具有抗菌活性［10］，方枝柏、高山柏挥发油同时具有较强的杀虫活性［11］。本课题组前期研究发现，香柏干燥枝叶中挥发油含有量高达3.50%，并具有抗炎活性［12］，因此刺柏属植物的挥发性成分值得进一步研究与开发。

迄今为止，HS-GC-MS 法已广泛应用于中草药挥发性成分的研究［13］，与传统的水蒸气蒸馏法比较，该方法样品需要量小，前处理简单，操作完全自动化［14］。刺柏属植物采样困难，采样量少，并且在传统应用中将其枝叶干燥后点燃作为熏香使用，顶空进样方式更贴近于实际应用，故本实验采用HS-GC-MS 法对刺柏属6种植物枝叶和果实中挥发性成分进行分析，为刺柏属植物的进一步研发提供理论依据。

1 材料

Shimadzu AOC-5000 Plus 自动顶空进样器、Shimadzu GCMS-QP2010 Ultra 型气相色谱-质谱联用仪（日本岛津公司）；TG-5MS 毛细管柱（320 μm × 30 m，1 μm）（美国Thermo 公司）；AL204 电子天平（万分之一，梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；C7～C40正构烷烃混标标准品（安谱实验科技股份有限公司）。

6种刺柏属植物的枝叶和果实在西藏采集，经西藏大学德吉博士鉴定为正品，标本存放于复旦大学药学院生药学教研室，信息见表1。

2 方法与结果

2.1 分析条件

2.1.1 顶空进样 分别精密称取干燥的6种刺柏属植物枝叶和大果圆柏及滇藏方枝柏果实粉末0.002 g，放入20 mL顶空瓶中，密封后置于样品盘内，进样体积2 mL；体积流量 1.0 mL／min；不分流模式；加热温度 120 ℃；加热时间20 min；振动速度 400 r／min；加热程序加热 10 s，静止10 s。

表1 样品信息

2.1.2 气相色谱 TG-5MS 石英毛细管非极性柱（30 m×0.32 mm，1.00 μm）；载气 He；柱体积流量 1.0 mL／min；进样口温度 250 ℃；柱温程序起始柱温 40 ℃（保持8 min），以 1 ℃ ／min 升至 250 ℃（保持 30 min）；进样量1 μL；不分流。

2.1.3 质谱 电子轰击（EI）离子源；能量70 eV；离子源温度250 ℃；接口温度 280 ℃；质量扫描范围m／z50～1 000；质谱标准检索库 NIST14。

2.2 GC-MS

2.2.1 挥发性成分总离子流图 在 “2.1”项条件下对正构烷烃标准品，刺柏属植物密枝圆柏、高山柏、垂枝香柏和香柏的枝叶，以及大果圆柏和滇藏方枝柏枝叶和果实中挥发性成分进行HS-GC-MS 分析，得到总离子流图，见图1，样品及主峰编号见表2。

2.2.2 挥发性成分组分分析 所得GC-MS 谱图数据经NIST14 谱图库检索解析，结合相对保留指数查对文献，确认各化合物［15-18］，共鉴定出62种挥发性成分，并采用面积归一法确定其相对含有量，见表2。

密枝圆柏枝叶中共鉴定出挥发性成分42种，占全部挥发性成分相对含有量的98.82%，共6 类组分，其中单萜烯类 13种，占 74.13% ；含氧倍半萜类 7种，占 15.15% ；倍半萜烯类14种，占 6.67%；含氧二萜类 1种，占 1.81%；含氧单萜类 5种，占 1% ；异戊酸酯类 1种，占 0.06% ，主要成分为 α-蒎烯（44.51% ）、β-蒎烯（12.36% ）、D-柠檬烯（9.54%）和榄香醇（9.32%）。

高山柏枝叶中共鉴定出挥发性成分43种，占全部挥发性成分相对含有量的97.65%，成分类别与密枝圆柏相同，但13种倍半萜烯类的含有量占14.14%，是密枝圆柏的2倍以上，主 要成分 为 β-蒎烯（28.23%）、伪 柠 檬 烯（17.3%）、α-蒎烯（13.42%）、茅苍术醇（6.79%）和榄香醇（6.38%）。

垂枝香柏枝叶中共鉴定出挥发性成分35种，相对含有量占总成分的90.08%，只鉴定出5 类组分，不含异戊酸酯类，主要成分为α-松油烯（33.7% ）、α-蒎烯（13.7% ）和β-蒎烯（10.93%）。

图1 枝叶和果实中挥发性成分总离子流图

香柏枝叶中共鉴定出挥发性成分39种，相对含有量占总成分的97.66%，同样为6 类组分，但其中单萜烯类含有量明显较其他5种刺柏属植物高，占84.17%，主要成分为β-蒎 烯（38.13%）、β-月桂烯（21.19%）和α-蒎烯（20.5% ）。

大果圆柏枝叶中共鉴定出挥发性成分44种，相对含有量占总成分的98.25%，也包括6 类组分，其中含氧倍半萜类含有量在6种刺柏属植物中最高，占21.64%，主要成分为 β-蒎 烯（37.34%）、α-蒎烯（18.84%）和榄香醇（16.59% ）。

滇藏方枝柏枝叶中共鉴定出挥发性成分41种，相对含有量占总成分的91.74%，鉴定出5 类组分，不含异戊酸酯类，而且其中倍半萜烯类含有量较其他5种刺柏属植物高，占25.76% 。主要为 β-蒎烯（29.86%）、α-蒎烯（11.8%）、大根香叶烯D-4-ol（8.25%）、榄香醇（7.57%）和 γ-荜澄茄烯（6.68%）。

表2 枝叶和果实中挥发性成分

续表2

2种果实成分与各自的枝叶相比有所减少，成分类别与枝叶相同，但单萜烯含有量明显提高，高达80% 以上，而含氧倍半萜、倍半萜类明显减少。其中从大果圆柏果实中共鉴定出38种成分，相对含有量占总成分的99.52%，主要为 β-蒎烯（45.41%）、α-蒎烯（24.35%）和榄香醇（8.66%）；滇藏方枝柏果实中鉴定出的35种成分占总含有量的 96.37%，主 要 为 β-蒎 烯（56.59%）和 α-蒎 烯（13.58% ）。

2.2.3 挥发性成分聚类分析 比较刺柏属植物枝叶和果实的挥发性成分可知，其组成成分类别相似，但果实部位单萜烯类相对含有量达到80%以上，最主要的成分β-蒎烯含有量超过45%，与枝叶差异显著。为了进一步区分不同种刺柏属植物枝叶之间的差别，对其挥发性成分进行聚类分析。

本实验应用SPSS 20.0 软件，采用系统聚类方法，以Ward’s 聚类法的 Educlidean 距离为测度，62种挥发性成分的相对含有量为变量，进行聚类分析，结果见图2。在距离为25 时将6种刺柏属植物聚为2 类，其中密枝圆柏和垂枝香柏分为一类，其余4种分为第二类；大果圆柏和滇藏方枝柏在距离为1 时聚在一起，距离系数最小，共有成分有30种，共有成分含有量达到70%以上，两者在挥发性成分类别和相对含有量上都比较相似，且都以β-蒎烯与α-蒎烯为最主要的2种成分；大果圆柏、滇藏方枝柏、高山柏和香柏在距离为7 时聚为一大类，24种共有成分含有量也达到70%以上，其中最高的成分均为β-蒎烯，香柏因其βmyrcene 含有量与其他3种刺柏属植物差异较大而距离更远；密枝圆柏和垂枝香柏在距离为20 时聚为一类，距离系数大，虽然25种共有成分相对含有量高达80%以上，但其主要成分不同，分别为α-蒎烯和α-松油烯，对聚类结果影响较大。

图2 枝叶挥发性成分聚类树状图

3 讨论

本实验分别称取 20、10、5、2 mg 刺柏属植物枝叶和果实粉末，对样品质量条件进行优化，结果显示当样品量为5、2 mg 时，分离色谱峰效果较好，因此确定样品用量为2 mg。与已报道的传统水蒸气法对比，涂永勤等［16］从100 g 香柏中提取挥发油鉴别其挥发性成分，董艳芳等［17］称取200 g 垂枝香柏提取其挥发油，可见顶空进样法用样量极少，不需提取，操作简便快捷。

通过HS-GC-MS 法基本可以将刺柏属植物果实和枝叶部分从挥发性成分上加以区分，尤其各主成分含有量占比较高，对区分不同部位及不同品种样品的贡献较大。针对香柏这一种植物，可对其果实进行进一步研究，进而探讨其特殊性。同时，不同种刺柏属植物挥发性成分之间的差异与其DNA 分子鉴定和药效作用的相关性也值得进一步探究。

α-蒎烯和β-蒎烯是6种刺柏属植物枝叶和果实中挥发性成分所共有的，且相对含有量高居前三位。研究表明，α-蒎烯能通过抑制真菌的DNA、RNA，多糖以及麦角固醇的生物合成而达到抗真菌的作用［19］，对植物害虫如食菌小蠹、松小蠹、红脂大小蠹等具有引诱能力［20-22］；β-蒎烯具有抗菌、抗病毒及抗肿瘤作用［23-24］。由此可见，这 2种化合物对刺柏属植物的生物活性有重要影响意义。

涂永勤等［16］从香柏挥发油中分析鉴定出α-杜松醇、α-小茴香烯和 3，-7，-11-甲基-2，-6，-10-十二碳三烯-1-醇，董艳芳等［17］在垂枝香柏挥发油中鉴定出桧烯、α-可巴烯-11-醇、烃类含氧衍生物、4-萜品醇，Wedge 等［11］提取的高山柏挥发油中含有量较高者为桧烯、α-蒎烯、榄香醇和松油烯-4-醇，Staub 等［25］采用顶空-气质法分析出高山柏香烟中α-杜松烯含有量最高。与本实验所报道的刺柏属植物挥发性成分存在显著差异，分析原因除了挥发油提取与顶空采集方式的区别外，很可能与样品的产地有关。

4 结论

本实验首次采用HS-GC-MS 法对刺柏属植物6种枝叶和2种果实的挥发性成分进行了分析，通过谱库检索和文献查阅，从枝叶中鉴定出62 个化合物，果实中鉴定出38个化合物，2 个部位的挥发性成分有明显差异，并且不同种枝叶的主成分也有一定差异，为进一步研究刺柏属植物不同部位、品种间的药效差异提供参考。该方法较传统水蒸气蒸馏法用样量少，且操作简便，实现了刺柏属植物枝叶和果实挥发性成分的快速检测，为进一步开发利用该属植物提供理论依据。